蛋白质和糖学技术讨论

做ERM蛋白家族moesin蛋白的磷酸化，WB一直跑不出来条带

楼主收藏举报帖子创建时间: 2018-03-14 16:14 回复：3 关注量：243

提取小鼠视网膜组织蛋白，WB做moesin的磷酸化，actin和总蛋白条带都没有问题，所以感觉WB操作步骤应该没问题，但是磷酸化moesin总是跑不出条带，一抗用的是abcam的抗体，裂解液里也有加蛋白酶抑制剂，请各位大神指点可能是哪里出了问题。

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xiao灵魂 2018-03-14 16:34
#1

除了加蛋白酶抑制剂，还要额外加一些磷酸酶的抑制剂。另外磷酸化的过程很快，所以裂解细胞时尽量操作迅速。
gemini91-med 2018-03-15 09:14
#2

另，蛋白样品需新鲜；跑磷酸化蛋白可相对增加上样量、一二抗浓度，换超高敏发光液，延长曝光时间等。
四叶草jasmine 2018-03-16 19:28
#3

感谢回复！提蛋白的时候磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂都有加，取完组织后超声匀浆，冰上裂解30min后4度离心15min，感觉这个过程似乎没有什么问题。现在唯一回想起来不太合适的地方是我取完组织后没有立即液氮保存，而是放在冰上大概3h后才开始提蛋白，不知道是不是放在冰上太久了，会导致已经去磷酸化了？

xiao灵魂帖子创建时间: 2018-03-14 16:34

除了加蛋白酶抑制剂，还要额外加一些磷酸酶的抑制剂。另外磷酸化的过程很快，所以裂解细胞时尽量操作迅速。

gemini91-med 帖子创建时间: 2018-03-15 09:14

另，蛋白样品需新鲜；跑磷酸化蛋白可相对增加上样量、一二抗浓度，换超高敏发光液，延长曝光时间等。

四叶草jasmine 帖子创建时间: 2018-03-16 19:28

感谢回复！提蛋白的时候磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂都有加，取完组织后超声匀浆，冰上裂解30min后4度离心15min，感觉这个过程似乎没有什么问题。现在唯一回想起来不太合适的地方是我取完组织后没有立即液氮保存，而是放在冰上大概3h后才开始提蛋白，不知道是不是放在冰上太久了，会导致已经去磷酸化了？

eenzyme	楼主 \| 收藏 \| 举报 \| 管理 2018-03-14 16:14 浏览: 243 回复: 3 提取小鼠视网膜组织蛋白，WB做moesin的磷酸化，actin和总蛋白条带都没有问题，所以感觉WB操作步骤应该没问题，但是磷酸化moesin总是跑不出条带，一抗用的是abcam的抗体，裂解液里也有加蛋白酶抑制剂，请各位大神指点可能是哪里出了问题。
eenzyme	楼主 \| 收藏 \| 举报 \| 管理 2018-03-14 16:14 浏览: 243 回复: 3 提取小鼠视网膜组织蛋白，WB做moesin的磷酸化，actin和总蛋白条带都没有问题，所以感觉WB操作步骤应该没问题，但是磷酸化moesin总是跑不出条带，一抗用的是abcam的抗体，裂解液里也有加蛋白酶抑制剂，请各位大神指点可能是哪里出了问题。