如何在革兰氏阴性菌中使得药物的进入速度大于被排出的速度，使得药物能累积到有效浓度，来自美国伊利诺伊大学的 Paul J. Hergenrother 等人给出了新的策略。他们研究了超过 180 种能进入并在大肠杆菌中累积的不同药物，发现胺类、两亲性且刚性、结构球形度低的分子更容易留在大肠杆菌中。用这种策略他们对一种原本只作用于革兰氏阳性菌的天然产物——脱氧尼博霉素（Deoxynybomycin，DNM）进行了改造，得到的新化合物活性大变，可以抑制多药耐药的革兰氏阴性病菌。这一激动人心的成果发表在了 Nature 上。

Paul Hergenrother 教授（前排）研究团队

大部分抗生素都是天然产物或其衍生物，考虑到结构复杂性和多样性，作者选取了 100 个代表性的化合物，从分子结构、分子量、ClogD7.4 和电荷进行分析它们在大肠杆菌 E. coli MG1655 中的累积能力，虽有研究发现化合物的累积程度和 ClogD7.4 相关，但从图 1 可以看出，结论与之大相径庭。在这 100 个化合物中，电荷是首要因素，带正电荷的化合物最易累积（12/41）。相比之下中性化合物（0/39）和带负电荷化合物（0/20）没有一个能在大肠杆菌中累积，即使是羧酸（ClogD7.4 < -5）也没有累积。这 12 个化合物都是胺类化合物，其中 8 个是伯胺。将氨基转变为羧酸、酰胺、酯、氰基、叠氮、醇，都削弱了累积能力，甚至连胺上有取代基都不行。

图 1. 不同电荷化合物在 E.Coli 中的累积能力

作者随后的研究对象是 68 种不同结构的伯胺化合物。虽有 36 个伯胺化合物具有累积能力，但也没有充分的理由认为伯胺就是关键因素，毕竟还有 32 个伯胺化合物没有表现出在大肠杆菌中累积。将这些化合物的化学信息进一步归类分析，作者发现分子的柔性（用可旋转的化学键来表征）和形状（用球形度来表征）是能否累积的关键因素。球形度是个相对的参数，如纯平面的苯球形度为 0，而球形的金刚烷球形度为 1。如图 2 所示，化合物具有相似的官能团时比较累积能力，刚性结构（化合物 16 只有 4 个可旋转键）大于柔性结构（化合物 17 有 13 个可旋转键），而低球形度化合物（化合物 18 为 0.14）大于高球形度化合物（化合物 19 为 0.49）。最终作者得出结论，刚性（不多于 5 个可旋转键）且球形度不高于 0.25 的伯胺化合物，具有更高的在大肠杆菌中累积的可能性。

图 2. 相似官能团化合物的累积能力

根据这个原则，作者将目光瞄向了脱氧尼博霉素 DNM，它是一种强效抑制革兰氏阳性菌的天然产物分子，对革兰氏阴性菌没有活性。DNM 的结构同时兼有两个关键参数：刚性和较低的球形度，它没有可旋转的化学键，球形度仅为 0.02。作者设想如果在合适的部位引入氨基，就有可能将其改造为对付革兰氏阴性菌的大杀器。首先试验的是伯胺衍生物和扩环衍生物，将原来的 5 元环扩展为 6 元环，得到 6DNM。没有伯胺基团的 6DNM 对革兰氏阳性的金黄色酿脓葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的活性为 MIC = 0.06–1 μg/ml，但它对大肠杆菌没有活性（MIC > 32 μg/ml），累积能力很弱。引入氨基后的 6DNM-NH3 不仅保持着对金黄色酿脓葡萄球菌的活性（MIC = 0.03-0.5 μg/ml），还获得了对大肠杆菌 E. coli MG1655 的活性（MIC = 0.5 μg/ml），累积能力也大大提高。如果氨基被乙酰化或者被羧酸基团替代，抗大肠杆菌活性以及累积能力也随之消失。

图 3. 6DNM 和 6DNM-NH3 的结构和活性

进一步的实验表明，6DNM-NH3 并且对常见的革兰氏阴性病菌都表现出了很好的抑制活性，ESKAPE（E. coli, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa）中也仅仅对 P. aeruginosa 无效。更惊人的还在后面，对于一株多药耐药的大肠杆菌（ATCC BAA-2469），第三代喹诺酮类抗生素环丙沙星（ciprofloxacin）无可奈何（MIC > 64 μg/ml），而 6DNM-NH3 可以轻易杀灭（MIC = 4 μg/ml）。

作者还研究了 6DNM-NH3 在大肠杆菌中累积的原因，6DNM-NH3 的伯胺基团与细菌膜上孔蛋白（porin）的一个关键天冬氨酸残基的相互作用是其中的关键。

图 4. 伯胺基团存在（a/b）与不存在（c/d）的差别，图中紫色为孔蛋白关键天冬氨酸残基 Asp113

能抑制革兰氏阴性菌的抗生素一直是科学家苦苦探索的目标，Hergenrother 教授团队的这项研究为设计或改造抗生素提供了新的策略，化合物的电荷、刚性和分子形状都会影响其在革兰氏阴性菌中的累积及生物活性。运用这一策略，不仅能够将只对革兰氏阳性菌有活性的化合物修饰为广谱抗生素，如 6DNM-NH3，同时，还能指导新化合物的设计。这一成果对于人类对抗革兰氏阴性菌有着重要的意义。

如何在革兰氏阴性菌中使得药物的进入速度大于被排出的速度，使得药物能累积到有效浓度，来自美国伊利诺伊大学的 Paul J. Hergenrother 等人给出了新的策略。他们研究了超过 180 种能进入并在大肠杆菌中累积的不同药物，发现胺类、两亲性且刚性、结构球形度低的分子更容易留在大肠杆菌中。用这种策略他们对一种原本只作用于革兰氏阳性菌的天然产物——脱氧尼博霉素（Deoxynybomycin，DNM）进行了改造，得到的新化合物活性大变，可以抑制多药耐药的革兰氏阴性病菌。这一激动人心的成果发表在了 Nature 上。

Paul Hergenrother 教授（前排）研究团队

大部分抗生素都是天然产物或其衍生物，考虑到结构复杂性和多样性，作者选取了 100 个代表性的化合物，从分子结构、分子量、ClogD7.4 和电荷进行分析它们在大肠杆菌 E. coli MG1655 中的累积能力，虽有研究发现化合物的累积程度和 ClogD7.4 相关，但从图 1 可以看出，结论与之大相径庭。在这 100 个化合物中，电荷是首要因素，带正电荷的化合物最易累积（12/41）。相比之下中性化合物（0/39）和带负电荷化合物（0/20）没有一个能在大肠杆菌中累积，即使是羧酸（ClogD7.4 < -5）也没有累积。这 12 个化合物都是胺类化合物，其中 8 个是伯胺。将氨基转变为羧酸、酰胺、酯、氰基、叠氮、醇，都削弱了累积能力，甚至连胺上有取代基都不行。

图 1. 不同电荷化合物在 E.Coli 中的累积能力

作者随后的研究对象是 68 种不同结构的伯胺化合物。虽有 36 个伯胺化合物具有累积能力，但也没有充分的理由认为伯胺就是关键因素，毕竟还有 32 个伯胺化合物没有表现出在大肠杆菌中累积。将这些化合物的化学信息进一步归类分析，作者发现分子的柔性（用可旋转的化学键来表征）和形状（用球形度来表征）是能否累积的关键因素。球形度是个相对的参数，如纯平面的苯球形度为 0，而球形的金刚烷球形度为 1。如图 2 所示，化合物具有相似的官能团时比较累积能力，刚性结构（化合物 16 只有 4 个可旋转键）大于柔性结构（化合物 17 有 13 个可旋转键），而低球形度化合物（化合物 18 为 0.14）大于高球形度化合物（化合物 19 为 0.49）。最终作者得出结论，刚性（不多于 5 个可旋转键）且球形度不高于 0.25 的伯胺化合物，具有更高的在大肠杆菌中累积的可能性。

图 2. 相似官能团化合物的累积能力

根据这个原则，作者将目光瞄向了脱氧尼博霉素 DNM，它是一种强效抑制革兰氏阳性菌的天然产物分子，对革兰氏阴性菌没有活性。DNM 的结构同时兼有两个关键参数：刚性和较低的球形度，它没有可旋转的化学键，球形度仅为 0.02。作者设想如果在合适的部位引入氨基，就有可能将其改造为对付革兰氏阴性菌的大杀器。首先试验的是伯胺衍生物和扩环衍生物，将原来的 5 元环扩展为 6 元环，得到 6DNM。没有伯胺基团的 6DNM 对革兰氏阳性的金黄色酿脓葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的活性为 MIC = 0.06–1 μg/ml，但它对大肠杆菌没有活性（MIC > 32 μg/ml），累积能力很弱。引入氨基后的 6DNM-NH3 不仅保持着对金黄色酿脓葡萄球菌的活性（MIC = 0.03-0.5 μg/ml），还获得了对大肠杆菌 E. coli MG1655 的活性（MIC = 0.5 μg/ml），累积能力也大大提高。如果氨基被乙酰化或者被羧酸基团替代，抗大肠杆菌活性以及累积能力也随之消失。

图 3. 6DNM 和 6DNM-NH3 的结构和活性

进一步的实验表明，6DNM-NH3 并且对常见的革兰氏阴性病菌都表现出了很好的抑制活性，ESKAPE（E. coli, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa）中也仅仅对 P. aeruginosa 无效。更惊人的还在后面，对于一株多药耐药的大肠杆菌（ATCC BAA-2469），第三代喹诺酮类抗生素环丙沙星（ciprofloxacin）无可奈何（MIC > 64 μg/ml），而 6DNM-NH3 可以轻易杀灭（MIC = 4 μg/ml）。

作者还研究了 6DNM-NH3 在大肠杆菌中累积的原因，6DNM-NH3 的伯胺基团与细菌膜上孔蛋白（porin）的一个关键天冬氨酸残基的相互作用是其中的关键。

图 4. 伯胺基团存在（a/b）与不存在（c/d）的差别，图中紫色为孔蛋白关键天冬氨酸残基 Asp113

能抑制革兰氏阴性菌的抗生素一直是科学家苦苦探索的目标，Hergenrother 教授团队的这项研究为设计或改造抗生素提供了新的策略，化合物的电荷、刚性和分子形状都会影响其在革兰氏阴性菌中的累积及生物活性。运用这一策略，不仅能够将只对革兰氏阳性菌有活性的化合物修饰为广谱抗生素，如 6DNM-NH3，同时，还能指导新化合物的设计。这一成果对于人类对抗革兰氏阴性菌有着重要的意义。