关于细胞培养的问题及解答

楼主  收藏   举报   帖子创建时间:  2017-06-27 15:28 回复:0 关注量:175
1.液体培养基的保存是冷藏好?还是冷冻好?
要冷藏!因为液体培养基经冷冻后再经溶化时,其溶液的PH值会发生改变,溶液往往变碱,某些成分溶解也会受到影响对细胞生长不利。故液体培养基一定要存放在冷藏箱中,通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月~一年。


2.液体培养基中谷氨酰胺的作用,及使用方法。
几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求,细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡。所以,各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置-20◦C冰冻保存,用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基4◦C冰箱储存两周以上时,应重新加入原来量的谷氨酰胺。

3.培养用液pH对细胞生长的影响
由于,大多数细胞适宜pH为7.2~7.4,偏离此范围对细胞将产生有害的影响。各种细胞对pH的要求也不完全相同,原代培养细胞一般对pH变动耐受差,无限细胞系耐受力强。

但总体来说,细胞耐酸性比耐碱性强一些,偏酸环境中更利于细胞生长。因此,我们在配制培养用液时,可把液体的pH稍微调得偏酸一些。液体在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时,溶液的PH还会向上浮动0.2左右。

4.常用培养基及培养用液的渗透压范围
培养基名称渗透压范围(mOSM)
DMEM(高糖)315~350
DMEM(低糖)270~330
RPMI-1640260~290
MEM-EBSS280~310
MEM-NEAA280~310
McCoy5a280~310
MEM-a280~310
M—199275~305
IMDM270~300
DMEM/F-12280~310
F—10270~300
F—12275~300

培养基名称渗透压范围(mOSM)
L—15280~320
D-Hanks280~300
Hanks280~300

PBS275~300

5.细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗?
不见得!因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++,Mg++离子和血清等因素有关。通常情况下,pH8.0,温度37oC其作用能力最强。另外,钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。我们每次进行传代消化前,一定要用D-Hanks液或PBS液反复冲洗细胞培养瓶,以便于将含血清的培养基冲洗干净,这样就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液浓度为:
(1)0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA;
(2)0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA。
(3)0.25%胰蛋白酶
溶液pH8.0~9.0;使用D-Hank液配制。
多数细胞传代消化可使用0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA这种消化液。

6.培养基在使用过程中应注意的问题:
(1)培养基在使用前需37oC预热或在室温平衡后再使用。
(2)细胞培养过程中,吸取过培养液的吸管不能再用火焰烧灼,防止残留在吸管内的培养基焦化,将有害物质带入培养液中。
(3)尽量缩短各种液体、细胞的暴露时间。
(4)避免液体间、细胞间的交叉污染。
(5)配制完全培养基时,配制的量最好在2周内用完为好。

7.血清的有关问题:
新生牛血清:新出生牛5天内取血制成
小牛血清:小牛出生16周以内采血制成。
胎牛血清:(进口血清)要求剖腹取胎制成。
国内厂家往往不能做到,经常把出生2天以内采血称为胎牛血清。
根据血清的生产工艺及血红蛋白、内毒素含量又分为:
(1).特级胎牛血清:40纳米过滤,内毒素含量≤10EU,血红蛋白含量≤10mg/dl。
(2).优等胎牛血清:经过3次100纳米过滤,内毒素含量≤25EU/ml,血红蛋白含量≤25mg/ml。
(3).标准胎牛血清:3次100纳米过滤,低内毒素,低血红蛋白含量。
(4).活性碳/葡聚糖处理血清:激素含量大大降低。
(5).透析型胎牛血清:次黄嘌呤和胸腺核苷含量大大降低。

8.其他细胞培养用液:

除培养基、血清、谷氨酰胺外,其他几种液体也属必须,不可省略。
(1)双抗:200倍,(1ml/支)其终浓度为青霉素100U/ml;链霉素100ug/ml,-24oC保存。
(2)L-谷氨酰胺:100倍,(1ml/支),终浓度2mM,-24oC保存。
(3)丙酮酸钠:配制浓度50mM,4ml/支,终浓度为1mM/ml,-24oC保存。
(4)Hepes液:配制浓度1M(5ml/支),一支Hepes加入到200ml
完全培养基中,终浓度为25mM/ml,常温保存。

9.支原体污染及检测:
(1)支原体污染在细胞培养中最常见、不易被查觉,但支原体污染可显著影响细胞功能干扰实验结果。支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小微生物,它无细胞壁,形态呈高度多形性,最小直径0.2um,可通过滤器。

目前通过对国内100余株/系细胞的检测,形势不容乐观。污染率达30%~60%。课题组从国外引进细胞株/系也经常出现支原体的污染。支原体在污染细胞后,它通过影响细胞的DNA、RNA的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来抑制细胞的生长,并能降低细胞的融合率。因此,在运用各种细胞系进行实验研究时,首先要证明所用细胞有无支原体的污染。

(2)支原体污染后,培养基可不发生浑浊,细胞病变轻微或不明显,因此难以发现。目前,支原体检测的方法有以下几种。
(a)相差显微镜观察;
(b).低张处理地衣红染色法;
(c)荧光染色法;
(d)酶标法;
(e)PCR法:使用该方法进行检测。
优点:灵敏度高,检测耗时短,样品量小
(只需50ul细胞培养用液上清)。
缺点:引物及制剂费用较高。