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【求助】核质分离RNA时的qPCR质控如何做归一化？

楼主收藏举报帖子创建时间: 2015-06-08 22:33 回复：34 关注量：1039

各位园友大家好，最近在做RNA的核质分离：
分离出细胞的细胞质RNA和细胞核RNA后，用荧光实时定量PCR的方法进行质控，但是不知道应该用何为内参基因（如下图A）（目的基因在total RNA / cytoplasmic RNA/ nuclear RNA的相对含量是如何确定的，ratio=2-ΔΔCt在此似乎没法用）：
参考文献：

Wei Y, et al. Journalof Biological Chemistry 2014,289: 10270-5
一般情况下：

当内参基因的Ct值在在control和sample中相同时：

但是，第一，内参基因（β-actin和U6）本身在细胞核和细胞质中的比例（“表达量”）就是不同的；第二，即使将细胞量绝对定量或核质分离时使用相同的细胞，提取过程中核RNA和质RNA的损耗也不可能完全相同；第三，而且本实验中它本身就是目的基因。所以不知用什么做归一化才能得到文章中的图呢？
而且，图中的总RNA的柱高又是如何得到的呢？
望大神们答疑解惑~

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水铃铛 2015-07-08 20:39
#1

你好，想问你是用什么试剂盒提的？我现在也要分离核质，然后检测RNA。谢谢
阿黄bine 2015-07-08 22:41
#2

是用的试剂盒来分离吗？
g261889902 2015-07-09 01:47
#3

水铃铛
你好，想问你是用什么试剂盒提的？我现在也要分离核质，然后检测RNA。谢谢

我没有用专门做RNA核质分离的试剂盒，用的普通的蛋白核质分离试剂盒（“细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒”(碧云天, P0028)）和RNA酶抑制剂（RecombinantRNase Inhibitor(TaKaRa, 2313A）（其他的RNase抑制剂如碧云天的RNase Inhibitor (R0102)应该也可以）。
如果研究的RNA丰度比较小（而且有的RNA在核质中的含量相差蛮大的），或者还要同时研究蛋白，推荐用PARIS? Instruction Manual(AM1921,Ambion^®;50preps)，可以同时分离二者，就是略贵，四千多RMB。
g261889902 2015-07-09 01:52
#4

阿黄bine
是用的试剂盒来分离吗？
见楼上
P.S其它方法文献：
g261889902 2015-07-09 02:00
#5

水铃铛
你好，想问你是用什么试剂盒提的？我现在也要分离核质，然后检测RNA。谢谢
请问你也是做qRT-PCR检测相对表达量吗？测出Ct后准备用什么公式计算目的基因在total RNA / cytoplasmic RNA/ nuclear RNA的相对含量呢？
水铃铛 2015-07-09 22:21
#6

我今天刚刚订了你推荐的这个试剂盒，AM1921，谢谢!
我还没有开始做，但是昨天微信认识一个小伙伴，他在做，试剂盒也是昨天他推荐我的，对于你提的问题我也很困惑，他说他这几天就做，做完分析结果给我看，到时候我再回复你。他用的内参是U1和GAPDH。我要检测的是lncRNA，你是不是要检测的miRNA？
g261889902 2015-07-10 15:25
#7

水铃铛
我今天刚刚订了你推荐的这个试剂盒，AM1921，谢谢!
我还没有开始做，但是昨天微信认识一个小伙伴，他在做，试剂盒也是昨天他推荐我的，对于你提的问题我也很困惑，他说他这几天就做，做完分析结果给我看，到时候我再回复你。他用的内参是U1和GAPDH。我要检测的是lncRNA，你是不是要检测的miRNA？

提前谢谢你了哈O(∩_∩)O~ 我也检测的是lncRNA，用的U6和GAPDH、β-actin进行核质分离的质控。
这里有篇文献有提到几种基因核质比例：
http://mcb.asm.org/content/28/22/6731.long
水铃铛 2015-07-16 11:18
#8

给你发了站内信
与日月争辉 2015-07-22 10:46
#9

18S和U6
与日月争辉 2015-07-22 10:47
#10

可以说一下你们使用的试剂盒和优化条件么

水铃铛帖子创建时间: 2015-07-08 20:39

你好，想问你是用什么试剂盒提的？我现在也要分离核质，然后检测RNA。谢谢

阿黄bine 帖子创建时间: 2015-07-08 22:41

是用的试剂盒来分离吗？

g261889902 帖子创建时间: 2015-07-09 01:47

水铃铛
你好，想问你是用什么试剂盒提的？我现在也要分离核质，然后检测RNA。谢谢

我没有用专门做RNA核质分离的试剂盒，用的普通的蛋白核质分离试剂盒（“细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒”(碧云天, P0028)）和RNA酶抑制剂（RecombinantRNase Inhibitor(TaKaRa, 2313A）（其他的RNase抑制剂如碧云天的RNase Inhibitor (R0102)应该也可以）。
如果研究的RNA丰度比较小（而且有的RNA在核质中的含量相差蛮大的），或者还要同时研究蛋白，推荐用PARIS? Instruction Manual(AM1921,Ambion^®;50preps)，可以同时分离二者，就是略贵，四千多RMB。

g261889902 帖子创建时间: 2015-07-09 01:52

阿黄bine
是用的试剂盒来分离吗？

见楼上
P.S其它方法文献：

g261889902 帖子创建时间: 2015-07-09 02:00

水铃铛
你好，想问你是用什么试剂盒提的？我现在也要分离核质，然后检测RNA。谢谢

请问你也是做qRT-PCR检测相对表达量吗？测出Ct后准备用什么公式计算目的基因在total RNA / cytoplasmic RNA/ nuclear RNA的相对含量呢？

水铃铛帖子创建时间: 2015-07-09 22:21

我今天刚刚订了你推荐的这个试剂盒，AM1921，谢谢!
我还没有开始做，但是昨天微信认识一个小伙伴，他在做，试剂盒也是昨天他推荐我的，对于你提的问题我也很困惑，他说他这几天就做，做完分析结果给我看，到时候我再回复你。他用的内参是U1和GAPDH。我要检测的是lncRNA，你是不是要检测的miRNA？

g261889902 帖子创建时间: 2015-07-10 15:25

水铃铛
我今天刚刚订了你推荐的这个试剂盒，AM1921，谢谢!
我还没有开始做，但是昨天微信认识一个小伙伴，他在做，试剂盒也是昨天他推荐我的，对于你提的问题我也很困惑，他说他这几天就做，做完分析结果给我看，到时候我再回复你。他用的内参是U1和GAPDH。我要检测的是lncRNA，你是不是要检测的miRNA？

提前谢谢你了哈O(∩_∩)O~ 我也检测的是lncRNA，用的U6和GAPDH、β-actin进行核质分离的质控。
这里有篇文献有提到几种基因核质比例：
http://mcb.asm.org/content/28/22/6731.long