bsseq 主要用来分析WGBS的数据, 安装过程如下

bsseq的分析主要包括以下4步：

1. 读取原始数据
2. BSmooth
3. t-test检验
4. DMR

1. 读取原始数据

bsseq要求的原始数据格式如下：

共6列数据，制表符分隔，每一行代表一个甲基化位点，前5列很好理解，描述甲基化位点的染色体位置和类别，默认情况下bbseq用于分析CpG类型的甲基化位点。当然其他类型的数据，比如CHG, CHH也支持，但是需要调整参数。Cov代表覆盖到这个位点的reads数，M代表其中发生了甲基化的reads数目。

每个样本一个这样的原始数据，用来表示该样本methylation calling的结果，这样的数据我们从bismark的结果中也可以得到。当原始数据准备好之后，首选需要读取所有样本的原始数据，然后导入到R中，生成一个bbseq定义的对象。在bbseq安装的路径下，提供了一个名为get_BS.chr22.R的脚本，展示了如何从读取所有样本原始数据的过程。

代码如下

这里以mc_imr90_r1_22和mc_imr90_r2_22两个样本的原始数据为例，详细展示了读取过程。我们只需要根据自己的数据，适当修改上述代码就可以了。主要注意sampleNames和pData数据就可以了。

2 Smooth

已测试数据BS.chr22为例，smooth的过程如下

在实际分析中，由于甲基化位点很多，所以这一步时间特别久，为了提高速度，可以添加mc.cores参数，这个参数指定了CPU个数，用于并行执行。

3. T-test

在分析之前，有必要过滤掉覆盖度较低的甲基化位点。通常保留在所有样本中覆盖度大于2的甲基化位点，但是也可以修改这个条件。过滤之后，直接通过BSmooth.tstat进行分析

下面的代码基于bsseqData包中的数据，这个数据包含了6个样本，分为normal和cancer两组

group1 指定属于treatment组的样本，group2指定属于control组的样本。

4. DMR

通过dmrFinder 函数进行差异甲基化分析， 代码如下：

cutoff 指定DMR的阈值，这个阈值根据t-test的结果进行调整。subset对差异甲基化的结果进行筛选，筛选包含甲基化位点个数大于3而且meanDiff 大于0.1的甲基化区域。