本文将以MACS为例，介绍ChIP-seq数据的处理流程。为节省篇幅，本文略去测序数据预处理、mapping reads等步骤，直接从peak-calling开始讲起。

一、首先粗略地介绍一下MACS的基本原理。

TF在基因组上的结合其实是一个随机过程，基因组的每个位置其实都有机会结合某个TF，只是概率不一样，说白了，peak出现的位置，是TF结合的热点，而peak-calling就是为了找到这些热点。

如何定义热点呢？通俗地讲，热点是这样一些位置，这些位置多次被测得的read所覆盖（我们测的是一个细胞群体，read出现次数多，说明该位置被TF结合的几率大）。那么，read数达到多少才叫多？这就要用到统计检验喽。假设TF在基因组上的分布是没有任何规律的，那么，测序得到的read在基因组上的分布也必然是随机的，某个碱基上覆盖的read的数目应该服从二项分布。这其实和高中大学课本上抽小球的过程是类似的。当n很大，p很小时，二项分布可以近似用泊松分布替代，在这里：

是泊松分布唯一的参数，n是测序得到的read总数目，l是单个read的长度，s是基因组的大小。有了分布，我们可以算出在某个置信概率（如0.00001）下，随机情况下，某个碱基上可以覆盖的read的数目的最小值，当实际观察到的read数目超过这个值（单侧检验）时，我们认为该碱基是TF的一个结合热点。反过来，针对每一个read数目，我们也可以算出对应的置信概率P。

但是，这只是一个简化的模型，实际情况要复杂好多。比如，由于测序、mapping过程内在的偏好性，以及不同染色质间的差异性，相比全基因组，某些碱基可能内在地会被更多的read所覆盖，这种情况得到的很多peak可能都是假的。MACS考虑到了这一点，当对某个碱基进行假设检验时，MACS只考虑该碱基附近的染色质区段（如10k），此时，上述公式中n表示附近10k区间内的read数目，s被置为10k。当有对照组实验（Control，相比实验组，没有用抗体捕获TF，或用了一个通用抗体）存在时，利用Control组的数据构建泊松分布，当没有Control时，利用实验组，稍大一点的局部区间（比如50k）的数据构建泊松分布。

这儿还有一个问题，read只是跟随着TF一起沉淀下来的DNA fragment的末端，read的位置并不是真实的TF结合的位置。所以在peak-calling之前，延伸read是必须的。不同TF大小不一样，对read延伸的长度也理应不同。我们知道，测得的read最终其实会近似地平均分配到正负链上，这样，对于一个TF结合热点而言，read在附近正负链上会近似地形成“双峰”。MACS会以某个window size扫描基因组，统计每个window里面read的富集程度，然后抽取（比如1000个）合适的（read富集程度适中，过少，无法建立模型，过大，可能反映的只是某种偏好性）window作样本，建立“双峰模型”。最后，两个峰之间的距离就被认为是TF的长度D，每个read将延伸D/2的长度。见下图：

当有对照组实验存在时，MACS会进行两次peak calling。第一次以实验组（Treatment）为实验组，对照组为对照组，第二次颠倒，以实验组为对照组，对照组为实验组。之后，MACS对每一个P计算了相应的FDR（False Discovery Rate）值：

表示第二次peak calling（颠倒的）得到的置信概率小于P的peak的个数。表示第一次peak calling得到的置信概率小于P的peak的个数。FDR综合利用了实验组和对照组的信息，显然，FDR越小越好。

二、MACS peak-calling pipeline：

MACS有两个版本，分别是MACS14和MACS2。MACS2在很多方面都对MACS14做了重大改进，但目前还在测试阶段。我们依然以MACS14为例进行说明。

安装下载源代码：http://github.com/downloads/taoliu/MACS/MACS-1.4.2-1.tar.gz

–prefix用于指定安装目录

最后，修改环境变量：

更多细节见安装包内的INSTALL文件。

假设我们现在有mouse的一组CTCF的ChIP-seq测序数据CTCF.fastq，首先，我们把这些reads map到mouse基因组（这里我们采用mm10）上。假设基因组的index文件已经建好，存在/path_to/文件夹下。

-m 最终只保留map上一次的reads

-S 输出文件格式是SAM

-q 输入文件格式是fastq

peak-callingmacs14 -t CTCF.sam -n CTCF –g mm-t 实验组数据文件名（相对对照组control而言，后面会进一步说明）-n 输出文件名前缀

-g 基因组的大致大小，-g number。MACS内置了一些基因组长度，“mm”表示小鼠的，“hs”表示人的，“ce”表示线虫，“dm”是果蝇。

运行成功后，将得到如下文件：

CTCF_model.r，CTCF_peaks.bed，CTCF_peaks.xls，CTCF_summits.bed

其中，CTCF_model.r以代码的形式保存了“双峰模型”。在终端中输入:

得到名为CTCF_model.pdf的文件，打开，如下图所示：

在某些情况下，比如，对组蛋白修饰的ChIP-seq数据peak-calling时，“双峰模型”会建立失败，这是因为组蛋白修饰往往并不是孤立存在的，可能很长一段染色质区间都被同一个组蛋白修饰占据，换句话说，组蛋白修饰的peak并不典型。这时，只要多加一个参数：

–nomodel –shiftsize=number

–nomodel将略过“双峰模型”建立的过程，而–shiftsize将人为指定reads延伸的长度。因为我们知道一个核小体上大概缠绕着147bp长的DNA，在对组蛋白修饰做peak-calling时我们可以指定：

–nomodel –shiftsize=73

CTCF_peaks.bed详细列出了每一个peak的位置信息和可信度（最后一列：)，BED文件格式详见：http://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat.html

CTCF_peaks.xls相比CTCF_peaks.bed包含了更多信息，包括本次程序运行的详细参数，每个peak的summit（覆盖最多延伸后reads的那个位置）信息等。

当我们有对照组实验数据时（Control.sam)：macs14 -t CTCF.sam  -c Control.sam -n CTCF –g mm输出文件类似，不过多出一个CTCF_negative_peaks.xls，顾名思义，是互换对照组实验组后得到的peak。

其他常用参数：-bw number 建立“双峰模型”过程中window size的一半，默认300bp.-p Pvalue 设定peak置信概率的临界值（threshold），默认0.00001，对于H3k36me3、H3k27me3、H3k9me3等具有“非常规”特征的peak（broad peak）而言，此参数可以稍微设大一点，比如0.001。

-m number1,number2 建立“双峰模型”用到，设定挑选的window上reads的富集程度（fold enrichment，相对全基因组而言），默认10,30。

-slocal=number -llocal=number 共同确定MACS动态计算时所考察的局部区间的长度。默认参数，-slocal=1000 -llocal=10000。这儿多说几句，除了建立“双峰模型”，在寻找peak过程中，MACS依然会以2倍于-bw的window扫描基因组，对于当前window而言（-slocal,-llocal取默认参数）：

其中，是基于全基因组的（实验组），基于当前window（默认参数下600bp）。当Control组存在时，均是基于Control组数据估算，当Control组不存在时，将不考虑，只考虑。

-w/-B 建立wig或BED格式的raw signal（最高精确到每个碱基上reads的覆盖情况）文件，默认每条染色体建一个。

-S 只建立一个raw signal文件。

-space 与-w搭配使用，确定wig文件的分辨率，默认10bp。

原文来自：http://www.zilhua.com/1562.html

本文将以MACS为例，介绍ChIP-seq数据的处理流程。为节省篇幅，本文略去测序数据预处理、mapping reads等步骤，直接从peak-calling开始讲起。

一、首先粗略地介绍一下MACS的基本原理。

TF在基因组上的结合其实是一个随机过程，基因组的每个位置其实都有机会结合某个TF，只是概率不一样，说白了，peak出现的位置，是TF结合的热点，而peak-calling就是为了找到这些热点。

如何定义热点呢？通俗地讲，热点是这样一些位置，这些位置多次被测得的read所覆盖（我们测的是一个细胞群体，read出现次数多，说明该位置被TF结合的几率大）。那么，read数达到多少才叫多？这就要用到统计检验喽。假设TF在基因组上的分布是没有任何规律的，那么，测序得到的read在基因组上的分布也必然是随机的，某个碱基上覆盖的read的数目应该服从二项分布。这其实和高中大学课本上抽小球的过程是类似的。当n很大，p很小时，二项分布可以近似用泊松分布替代，在这里：

是泊松分布唯一的参数，n是测序得到的read总数目，l是单个read的长度，s是基因组的大小。有了分布，我们可以算出在某个置信概率（如0.00001）下，随机情况下，某个碱基上可以覆盖的read的数目的最小值，当实际观察到的read数目超过这个值（单侧检验）时，我们认为该碱基是TF的一个结合热点。反过来，针对每一个read数目，我们也可以算出对应的置信概率P。

但是，这只是一个简化的模型，实际情况要复杂好多。比如，由于测序、mapping过程内在的偏好性，以及不同染色质间的差异性，相比全基因组，某些碱基可能内在地会被更多的read所覆盖，这种情况得到的很多peak可能都是假的。MACS考虑到了这一点，当对某个碱基进行假设检验时，MACS只考虑该碱基附近的染色质区段（如10k），此时，上述公式中n表示附近10k区间内的read数目，s被置为10k。当有对照组实验（Control，相比实验组，没有用抗体捕获TF，或用了一个通用抗体）存在时，利用Control组的数据构建泊松分布，当没有Control时，利用实验组，稍大一点的局部区间（比如50k）的数据构建泊松分布。

这儿还有一个问题，read只是跟随着TF一起沉淀下来的DNA fragment的末端，read的位置并不是真实的TF结合的位置。所以在peak-calling之前，延伸read是必须的。不同TF大小不一样，对read延伸的长度也理应不同。我们知道，测得的read最终其实会近似地平均分配到正负链上，这样，对于一个TF结合热点而言，read在附近正负链上会近似地形成“双峰”。MACS会以某个window size扫描基因组，统计每个window里面read的富集程度，然后抽取（比如1000个）合适的（read富集程度适中，过少，无法建立模型，过大，可能反映的只是某种偏好性）window作样本，建立“双峰模型”。最后，两个峰之间的距离就被认为是TF的长度D，每个read将延伸D/2的长度。见下图：

当有对照组实验存在时，MACS会进行两次peak calling。第一次以实验组（Treatment）为实验组，对照组为对照组，第二次颠倒，以实验组为对照组，对照组为实验组。之后，MACS对每一个P计算了相应的FDR（False Discovery Rate）值：

表示第二次peak calling（颠倒的）得到的置信概率小于P的peak的个数。表示第一次peak calling得到的置信概率小于P的peak的个数。FDR综合利用了实验组和对照组的信息，显然，FDR越小越好。

二、MACS peak-calling pipeline：

MACS有两个版本，分别是MACS14和MACS2。MACS2在很多方面都对MACS14做了重大改进，但目前还在测试阶段。我们依然以MACS14为例进行说明。

安装下载源代码：http://github.com/downloads/taoliu/MACS/MACS-1.4.2-1.tar.gz

–prefix用于指定安装目录

最后，修改环境变量：

更多细节见安装包内的INSTALL文件。

假设我们现在有mouse的一组CTCF的ChIP-seq测序数据CTCF.fastq，首先，我们把这些reads map到mouse基因组（这里我们采用mm10）上。假设基因组的index文件已经建好，存在/path_to/文件夹下。

-m 最终只保留map上一次的reads

-S 输出文件格式是SAM

-q 输入文件格式是fastq

peak-callingmacs14 -t CTCF.sam -n CTCF –g mm-t 实验组数据文件名（相对对照组control而言，后面会进一步说明）-n 输出文件名前缀

-g 基因组的大致大小，-g number。MACS内置了一些基因组长度，“mm”表示小鼠的，“hs”表示人的，“ce”表示线虫，“dm”是果蝇。

运行成功后，将得到如下文件：

CTCF_model.r，CTCF_peaks.bed，CTCF_peaks.xls，CTCF_summits.bed

其中，CTCF_model.r以代码的形式保存了“双峰模型”。在终端中输入:

得到名为CTCF_model.pdf的文件，打开，如下图所示：

在某些情况下，比如，对组蛋白修饰的ChIP-seq数据peak-calling时，“双峰模型”会建立失败，这是因为组蛋白修饰往往并不是孤立存在的，可能很长一段染色质区间都被同一个组蛋白修饰占据，换句话说，组蛋白修饰的peak并不典型。这时，只要多加一个参数：

–nomodel –shiftsize=number

–nomodel将略过“双峰模型”建立的过程，而–shiftsize将人为指定reads延伸的长度。因为我们知道一个核小体上大概缠绕着147bp长的DNA，在对组蛋白修饰做peak-calling时我们可以指定：

–nomodel –shiftsize=73

CTCF_peaks.bed详细列出了每一个peak的位置信息和可信度（最后一列：)，BED文件格式详见：http://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat.html

CTCF_peaks.xls相比CTCF_peaks.bed包含了更多信息，包括本次程序运行的详细参数，每个peak的summit（覆盖最多延伸后reads的那个位置）信息等。

当我们有对照组实验数据时（Control.sam)：macs14 -t CTCF.sam  -c Control.sam -n CTCF –g mm输出文件类似，不过多出一个CTCF_negative_peaks.xls，顾名思义，是互换对照组实验组后得到的peak。

其他常用参数：-bw number 建立“双峰模型”过程中window size的一半，默认300bp.-p Pvalue 设定peak置信概率的临界值（threshold），默认0.00001，对于H3k36me3、H3k27me3、H3k9me3等具有“非常规”特征的peak（broad peak）而言，此参数可以稍微设大一点，比如0.001。

-m number1,number2 建立“双峰模型”用到，设定挑选的window上reads的富集程度（fold enrichment，相对全基因组而言），默认10,30。

-slocal=number -llocal=number 共同确定MACS动态计算时所考察的局部区间的长度。默认参数，-slocal=1000 -llocal=10000。这儿多说几句，除了建立“双峰模型”，在寻找peak过程中，MACS依然会以2倍于-bw的window扫描基因组，对于当前window而言（-slocal,-llocal取默认参数）：

其中，是基于全基因组的（实验组），基于当前window（默认参数下600bp）。当Control组存在时，均是基于Control组数据估算，当Control组不存在时，将不考虑，只考虑。

-w/-B 建立wig或BED格式的raw signal（最高精确到每个碱基上reads的覆盖情况）文件，默认每条染色体建一个。

-S 只建立一个raw signal文件。

-space 与-w搭配使用，确定wig文件的分辨率，默认10bp。

原文来自：http://www.zilhua.com/1562.html