下载

Consed 软件需要到  phrap 网站 申请， 申请 成功后 下载 相应操 作系 统的版 本， 如

consed_linux.tar.z。 申请地址：http://bozeman.mbt.washington.edu/consed/consed.html

安装

1. 将软件包上传到大型机上

2. 解压缩 zcat consed_linux.tar.Z | tar -xvf -

3. 环境变量配置

1）默认 CONSE_HOME 为/usr/local/genome，如果不使用这个目录，请建立相关链接， 并修改环境变量设置（.cshrc 或其他 shell 的配置文件）：setenv CONSED_HOME xxx，xxx 为 consed 安装的目录。

2 ）建 立 $CONSED_HOME/bin 和 $CONSED_HOME/lib 目录，可 执行 文件全 部放 到

$CONSED_HOME/bin 目录下

Consed 需要使用其他的一些软件，如：phred, phrap, crossmatch，这些文件需放到

/usr/local/genome/bin 目录下，或$CONSED_HOME/bin。

对于软件 phred，联系：bge@u.washington.edu (Brent Ewing)

对于软件 phrap 和 crossmatch， 联系：phg@u.washington.edu (Phil Green)

3)  编译 phd2fasta:

到 misc/phd2fasta 目录，键入命令'make'编译 phd2fasta，然后将 phd2fasta 可执行文件移到目录 /usr/local/genome/bin 或 $CONSED_HOME/bin)

4)  编译 mktrace:

到 misc/mktrace 目录，键入命令'make'编译 mktrace，然后将 mktrace 可执行文件 移到目录 /usr/local/genome/bin 或 $CONSED_HOME/bin)

5)  将所有的 perl 程序 （ scripts目录和contributions目录下）移到目录

/usr/local/genome/bin或 $CONSED_HOME/bin)，并修改权限为可执行(chmod a+x *)

图 2-5 consed 的输入选择界面

如果 phd_dir 目录缺失却需要强行打开 consed，必须加"-nophd"参数运行才能打开consed 界面，否则会报错退出。而在"-nophd"参数下，consed 的很多功能都无法实现，包 括查看每个 read 的质量、调整组装结果等等。而如果 chromat_dir 缺失，则不能查看 reads 的原始峰图。通常运行 consed 的时候都要求至少绝大多数 reads 的 phd 文件都存在。

以下的所有功能的实现都是在 consed 目录结构完整，reads 路径对应正确，并且参数配 备无误的情况进行的。

1．主界面布局：

主界面"Consed Main Window" read 列表。

从上到下依次排列了菜单区、功能键、contig列表和Contig 列表中的所有 contigs 按照包含 reads 从少到多的顺序排列。窗口中显示了contig 名称、拼成 contig 的 reads 数和 contig 的总长度等信息。

2．检查 contig 的组装质量：

在 contig 列表中双击一个 contig的名字，会弹出这个 contig 的窗口。窗口中以图形的方式显示了此 contig 的 组 装 情 况 。 最 上 面 一 行 的 碱 基 表 示 组 装 完 成 的 contig 序列（consensus），下面的每一行表示组成 contig 的每一条 read，在窗口的左端显示了每一条 read 的名字，名字后面的箭头代表 read 的测序方向。拼接质量是由碱基的背景色表示的，背 景色浅表示质量好，反之表示质量差。通过拖动滚动条，可以查看到整个 contig 的拼接情况。 如果需要查看某一个 read 的峰图，只需选中这个 read 上的碱基点击鼠标中键，就会弹出峰图（双键鼠标可以通过同时点击左右键来实现中键功能）。如图 2-7：

图 2-7 contig 窗口和 reads 峰图

对于比较大的 contig，手动检查的效率是很低的，所以 consed 提供了一系列统计以辅助 检查 contig 的拼接：

第一是提供了 contig 的平均单碱基错误率统计，以衡量 contig 的整体质量。这个信息显 示在 contig 窗口按键区"Err/10kb"的右边。如上图显示就是万分之 3.38 的错误率。

第二是提供了查找 contig 上组装有问题区域的功能。点击"navigate"按钮，下拉菜单中有很多查找选项，其中第一个选项 "Low Cons/High Qual Descrep/Single Stranded/Single Subclone/Unaligned High"选项，即查找全部有问题的组装区域。相比于这种 一网打尽的找法，分类寻 找往往更有针对性，所以最常用的是如下选项： "Low consensus quality"、"Region covered by only 1 subclone"和"High quality discrepancies/>5bp from unaligned region"，即低质量、单覆盖和高质量错配。

以查找低质量区为例，依次点击"navigate"->"Low consensus quality"，会弹出一 个窗口显示所有低于指定质量值（默认为 25）的区域，双击其中的任意一个结果，contig 窗口 就会显示这个位置附近的组装情况。点击"save"按键，弹出窗口显示的统计结果可以保存。如 图 2-8：

图 2-8 寻找 contig 的低质量区

3．提取组成 contig 的所有 reads 的位置信息：

在 contig窗口上点击"Info"按钮，选择"Show Contig Information"，就会弹出"Contig Information"窗口，显示所有 reads 在这个 contig 上的位置和方向。可以点击"Save"输出这些信息。如图 2-9

图 2-9 查看 contig 上 reads 的位置

4．查看 contig 之间的关系和正反向 reads 的覆盖情况：

在主窗口上点击按钮"Assembly View"会弹出一个窗口显示 contig 之间的正反向 reads关系，并将关系足够多的正反向连成 scaffold。在 contig 的上方会出现两条起伏的线，较高 的一条是浅绿色，表示亚克隆的覆盖度曲线；较低的一条是深绿色，表示组装的 reads 覆盖度曲线。这两条曲线突然降低的位置往往是组装结果中连接较弱的位置，甚至是错拼。因此这两条曲线能够用来粗略的检验序列组装的可靠性。如图 2-10：

图 2-10 Assembly View

如果想仔细观察正反向的覆盖情况，可以点击"Assembly view"窗口的"What to Show"， 在菜单中选择"Fwd/Rev Pairs"，选中正反像选项中的"Show each consistent fwd/rev pair within contigs"和"Show legs on squares for consistent fwd/rev pairs" 并点击"Apply"，就会在显示 contigs 之间的关系的同时也显示 contigs 内部的正反向关系， 能够比较方便的找到正反向覆盖异常的区域。

5．寻找组装结果中的重复区：

在"Assembly View"窗口点击"Sequence Matches"，会弹出 cross_match 比对的参数选项窗口。点击"run crossmatch"，程序会在所有的 contigs 之间进行比对，并把比对结 果绘制在"Assembly View"窗口里面的 contig 上，其中橙色线条代表正向比对的结果，黑色 代表反向比对。如图 2-11：

图 2-11 Assembly View 的比对功能

6．在 consed 中搜索序列：

打开"Search for String"窗口，从一个 contig 中选中一段序列（consed 设置为选中复制），用鼠标中键粘贴在"Query String"内（也可以键盘输入），然后点击"OK"，程序就 会找出这一段序列在所有结果中出现的位置。如图 2-12：

图 2-12 搜索序列

7．连接 contigs：

对于有重复区域的两个 contigs，我们可以把鼠标的焦点定在两个 contig 重复区域的同一个碱基上，在两个 contig 窗口里分别点击"Compare Cont"弹出比对窗口。点击窗口中间的 "Align"比对。查验比对结果没有问题可以接受以后，点击比对窗口右下角的 "join Contigs"，两个 contigs 就连起来了，如图 2-13 和 2-14。需要注意的是，如果两个 contigs是反向比对，则必须用按钮“Compl Cont”把其中一个 contig 变成互补序列，才能进行连接。

图 2-13 连接 contigs

在 contig窗口里选中选一个位置按右键，选择"Tear contig at this consensus position"，就会弹出一个窗口以供选择跨过这一碱基的每一个 reads 应该划分到上游还是下 游。选定之后点击"Do Tear"，原来的 contig 就拆成了 2 个。如果 2-15 和 2-16

图 2-15 拆分 contig

图 2-16 拆分后的 contigs

9．把一个 read 从 contig 中分离出来：

在 contig 窗口中选中需要分出来的 read，点鼠标右键，选择"Put read *** into its own contig"，即可把这条 read 从中分离出来。如图 2-17 和 2-18：

图 2-17 从 contig 中分离 reads

图 2-18 分离出来的 read 单独成为一个 contig

以上是一些常用的基本功能，其他的扩展功能读者可以慢慢摸索。需要注意的是，以上的功 能都是在参数配备完整的情况下实现的。如果 consed 实现某一功能的调用程序路径不对，会弹 出类似于这样的错误窗口：

图 2-19 错误 1

图 2-20 错误 2

遇到这种情况的需要重新配置 consed 的参数调用列表，方法如图 2-21，在主界面上点击 "Options"，选择"Edit Consed/Autofinish Parameters"，把报错的调用程序路径修 改为当前系统内的有效路径即可。使用 consed 时多数配置问题可以通过这种方法解决。

图 2-21 调整 consed 参数

输出

1．保存 ace 文件：

点击主窗口的“File”按钮，在菜单中选择"Save assembly"选项，可以用来保存修改后的 ace 文件。见图 2-22

图 2-22 保存 ace 文件

2．输出 contigs 序列：

点击主界面的“File”，选择"Write all contigs to fasta file"可以输出所有contigs。如果需要单独输出某一个 contig，可以在相应的 contig 窗口内点击"File"，选 择 "Export consensus sequence" 或 者 "Export consensus sequence (with options)"来指定输出完整 contig 还是部分序列、输出起止位点、是否输出质量、输出格式 是 fasta 还是 phd 等等。如图 2-23：

图 2-23 输出 contig 序列

常见问题

1．运行 consed 时报下列错误：

no ~/.consedrc file so no user resources will be used--that's ok no ./.consedrc file so no project-specific resources--that's ok couldn't open readOrder.txt--that's ok

Error: Can't open display:

这种情况通常是使用的远程登陆工具不支持图形界面。使用 X-win32 登陆即可解决。

2．运行 consed 时报下列错误：

no ~/.consedrc file so no user resources will be used--that's ok no ./.consedrc file so no project-specific resources--that's ok couldn't open readOrder.txt--that's ok

Fatal: The parent directory must contain phd_dir and chromat_dir, but it doesn't. A typical directory structure is a directory named after the project, with subdirectories named edit_dir (containing the ace files), phd_dir (containg the phd files), and chromat_dir (containing the chromatogram files). Consed would then be run from within edit_dir.

Version 14.00 (040827)

这是由于上级目录没有“phd_dir”。

下载

Consed 软件需要到  phrap 网站 申请， 申请 成功后 下载 相应操 作系 统的版 本， 如

consed_linux.tar.z。 申请地址：http://bozeman.mbt.washington.edu/consed/consed.html

安装

1. 将软件包上传到大型机上

2. 解压缩 zcat consed_linux.tar.Z | tar -xvf -

3. 环境变量配置

1）默认 CONSE_HOME 为/usr/local/genome，如果不使用这个目录，请建立相关链接， 并修改环境变量设置（.cshrc 或其他 shell 的配置文件）：setenv CONSED_HOME xxx，xxx 为 consed 安装的目录。

2 ）建 立 $CONSED_HOME/bin 和 $CONSED_HOME/lib 目录，可 执行 文件全 部放 到

$CONSED_HOME/bin 目录下

Consed 需要使用其他的一些软件，如：phred, phrap, crossmatch，这些文件需放到

/usr/local/genome/bin 目录下，或$CONSED_HOME/bin。

对于软件 phred，联系：bge@u.washington.edu (Brent Ewing)

对于软件 phrap 和 crossmatch， 联系：phg@u.washington.edu (Phil Green)

3)  编译 phd2fasta:

到 misc/phd2fasta 目录，键入命令'make'编译 phd2fasta，然后将 phd2fasta 可执行文件移到目录 /usr/local/genome/bin 或 $CONSED_HOME/bin)

4)  编译 mktrace:

到 misc/mktrace 目录，键入命令'make'编译 mktrace，然后将 mktrace 可执行文件 移到目录 /usr/local/genome/bin 或 $CONSED_HOME/bin)

5)  将所有的 perl 程序 （ scripts目录和contributions目录下）移到目录

/usr/local/genome/bin或 $CONSED_HOME/bin)，并修改权限为可执行(chmod a+x *)

图 2-5 consed 的输入选择界面

如果 phd_dir 目录缺失却需要强行打开 consed，必须加"-nophd"参数运行才能打开consed 界面，否则会报错退出。而在"-nophd"参数下，consed 的很多功能都无法实现，包 括查看每个 read 的质量、调整组装结果等等。而如果 chromat_dir 缺失，则不能查看 reads 的原始峰图。通常运行 consed 的时候都要求至少绝大多数 reads 的 phd 文件都存在。

以下的所有功能的实现都是在 consed 目录结构完整，reads 路径对应正确，并且参数配 备无误的情况进行的。

1．主界面布局：

主界面"Consed Main Window" read 列表。

从上到下依次排列了菜单区、功能键、contig列表和Contig 列表中的所有 contigs 按照包含 reads 从少到多的顺序排列。窗口中显示了contig 名称、拼成 contig 的 reads 数和 contig 的总长度等信息。

2．检查 contig 的组装质量：

在 contig 列表中双击一个 contig的名字，会弹出这个 contig 的窗口。窗口中以图形的方式显示了此 contig 的 组 装 情 况 。 最 上 面 一 行 的 碱 基 表 示 组 装 完 成 的 contig 序列（consensus），下面的每一行表示组成 contig 的每一条 read，在窗口的左端显示了每一条 read 的名字，名字后面的箭头代表 read 的测序方向。拼接质量是由碱基的背景色表示的，背 景色浅表示质量好，反之表示质量差。通过拖动滚动条，可以查看到整个 contig 的拼接情况。 如果需要查看某一个 read 的峰图，只需选中这个 read 上的碱基点击鼠标中键，就会弹出峰图（双键鼠标可以通过同时点击左右键来实现中键功能）。如图 2-7：

图 2-7 contig 窗口和 reads 峰图

对于比较大的 contig，手动检查的效率是很低的，所以 consed 提供了一系列统计以辅助 检查 contig 的拼接：

第一是提供了 contig 的平均单碱基错误率统计，以衡量 contig 的整体质量。这个信息显 示在 contig 窗口按键区"Err/10kb"的右边。如上图显示就是万分之 3.38 的错误率。

第二是提供了查找 contig 上组装有问题区域的功能。点击"navigate"按钮，下拉菜单中有很多查找选项，其中第一个选项 "Low Cons/High Qual Descrep/Single Stranded/Single Subclone/Unaligned High"选项，即查找全部有问题的组装区域。相比于这种 一网打尽的找法，分类寻 找往往更有针对性，所以最常用的是如下选项： "Low consensus quality"、"Region covered by only 1 subclone"和"High quality discrepancies/>5bp from unaligned region"，即低质量、单覆盖和高质量错配。

以查找低质量区为例，依次点击"navigate"->"Low consensus quality"，会弹出一 个窗口显示所有低于指定质量值（默认为 25）的区域，双击其中的任意一个结果，contig 窗口 就会显示这个位置附近的组装情况。点击"save"按键，弹出窗口显示的统计结果可以保存。如 图 2-8：

图 2-8 寻找 contig 的低质量区

3．提取组成 contig 的所有 reads 的位置信息：

在 contig窗口上点击"Info"按钮，选择"Show Contig Information"，就会弹出"Contig Information"窗口，显示所有 reads 在这个 contig 上的位置和方向。可以点击"Save"输出这些信息。如图 2-9

图 2-9 查看 contig 上 reads 的位置

4．查看 contig 之间的关系和正反向 reads 的覆盖情况：

在主窗口上点击按钮"Assembly View"会弹出一个窗口显示 contig 之间的正反向 reads关系，并将关系足够多的正反向连成 scaffold。在 contig 的上方会出现两条起伏的线，较高 的一条是浅绿色，表示亚克隆的覆盖度曲线；较低的一条是深绿色，表示组装的 reads 覆盖度曲线。这两条曲线突然降低的位置往往是组装结果中连接较弱的位置，甚至是错拼。因此这两条曲线能够用来粗略的检验序列组装的可靠性。如图 2-10：

图 2-10 Assembly View

如果想仔细观察正反向的覆盖情况，可以点击"Assembly view"窗口的"What to Show"， 在菜单中选择"Fwd/Rev Pairs"，选中正反像选项中的"Show each consistent fwd/rev pair within contigs"和"Show legs on squares for consistent fwd/rev pairs" 并点击"Apply"，就会在显示 contigs 之间的关系的同时也显示 contigs 内部的正反向关系， 能够比较方便的找到正反向覆盖异常的区域。

5．寻找组装结果中的重复区：

在"Assembly View"窗口点击"Sequence Matches"，会弹出 cross_match 比对的参数选项窗口。点击"run crossmatch"，程序会在所有的 contigs 之间进行比对，并把比对结 果绘制在"Assembly View"窗口里面的 contig 上，其中橙色线条代表正向比对的结果，黑色 代表反向比对。如图 2-11：

图 2-11 Assembly View 的比对功能

6．在 consed 中搜索序列：

打开"Search for String"窗口，从一个 contig 中选中一段序列（consed 设置为选中复制），用鼠标中键粘贴在"Query String"内（也可以键盘输入），然后点击"OK"，程序就 会找出这一段序列在所有结果中出现的位置。如图 2-12：

图 2-12 搜索序列

7．连接 contigs：

对于有重复区域的两个 contigs，我们可以把鼠标的焦点定在两个 contig 重复区域的同一个碱基上，在两个 contig 窗口里分别点击"Compare Cont"弹出比对窗口。点击窗口中间的 "Align"比对。查验比对结果没有问题可以接受以后，点击比对窗口右下角的 "join Contigs"，两个 contigs 就连起来了，如图 2-13 和 2-14。需要注意的是，如果两个 contigs是反向比对，则必须用按钮“Compl Cont”把其中一个 contig 变成互补序列，才能进行连接。

图 2-13 连接 contigs

在 contig窗口里选中选一个位置按右键，选择"Tear contig at this consensus position"，就会弹出一个窗口以供选择跨过这一碱基的每一个 reads 应该划分到上游还是下 游。选定之后点击"Do Tear"，原来的 contig 就拆成了 2 个。如果 2-15 和 2-16

图 2-15 拆分 contig

图 2-16 拆分后的 contigs

9．把一个 read 从 contig 中分离出来：

在 contig 窗口中选中需要分出来的 read，点鼠标右键，选择"Put read *** into its own contig"，即可把这条 read 从中分离出来。如图 2-17 和 2-18：

图 2-17 从 contig 中分离 reads

图 2-18 分离出来的 read 单独成为一个 contig

以上是一些常用的基本功能，其他的扩展功能读者可以慢慢摸索。需要注意的是，以上的功 能都是在参数配备完整的情况下实现的。如果 consed 实现某一功能的调用程序路径不对，会弹 出类似于这样的错误窗口：

图 2-19 错误 1

图 2-20 错误 2

遇到这种情况的需要重新配置 consed 的参数调用列表，方法如图 2-21，在主界面上点击 "Options"，选择"Edit Consed/Autofinish Parameters"，把报错的调用程序路径修 改为当前系统内的有效路径即可。使用 consed 时多数配置问题可以通过这种方法解决。

图 2-21 调整 consed 参数

输出

1．保存 ace 文件：

点击主窗口的“File”按钮，在菜单中选择"Save assembly"选项，可以用来保存修改后的 ace 文件。见图 2-22

图 2-22 保存 ace 文件

2．输出 contigs 序列：

点击主界面的“File”，选择"Write all contigs to fasta file"可以输出所有contigs。如果需要单独输出某一个 contig，可以在相应的 contig 窗口内点击"File"，选 择 "Export consensus sequence" 或 者 "Export consensus sequence (with options)"来指定输出完整 contig 还是部分序列、输出起止位点、是否输出质量、输出格式 是 fasta 还是 phd 等等。如图 2-23：

图 2-23 输出 contig 序列

常见问题

1．运行 consed 时报下列错误：

no ~/.consedrc file so no user resources will be used--that's ok no ./.consedrc file so no project-specific resources--that's ok couldn't open readOrder.txt--that's ok

Error: Can't open display:

这种情况通常是使用的远程登陆工具不支持图形界面。使用 X-win32 登陆即可解决。

2．运行 consed 时报下列错误：

no ~/.consedrc file so no user resources will be used--that's ok no ./.consedrc file so no project-specific resources--that's ok couldn't open readOrder.txt--that's ok

Fatal: The parent directory must contain phd_dir and chromat_dir, but it doesn't. A typical directory structure is a directory named after the project, with subdirectories named edit_dir (containing the ace files), phd_dir (containg the phd files), and chromat_dir (containing the chromatogram files). Consed would then be run from within edit_dir.

Version 14.00 (040827)

这是由于上级目录没有“phd_dir”。