一、方法的选择

首先是方法的选择。基于距离的方法有UPGMA、ME（Minimum Evolution，最小进化法）和NJ（Neighbor-Joining，邻接法）等。其他的几种方法包括MP（Maximum parsimony，最大简约法）、ML（Maximum likelihood，最大似然法）以及贝叶斯（Bayesian）推断等方法。其中UPGMA法已经较少使用。

一般来讲，如果模型合适，ML的效果较好。对近缘序列，有人喜欢MP，因为用的假设最少。MP一般不用在远缘序列上，这时一般用NJ或ML.对相似度很低的序列，NJ往往出现Long-branch attraction（LBA，长枝吸引现象），有时严重干扰进化树的构建。贝叶斯的方法则太慢。对于各种方法构建分子进化树的准确性，一篇综述（Hall BG. Mol Biol Evol 2005，22（3）：792-802）认为贝叶斯的方法最好，其次是ML，然后是MP。其实如果序列的相似性较高，各种方法都会得到不错的结果，模型间的差别也不大。

对于NJ和ML，是需要选择模型的。对于各种模型之间的理论上的区别，这里不作深入的探讨，可以参看Nei的书。对于蛋白质序列以及DNA序列，两者模型的选择是不同的。以作者的经验来说，对于蛋白质的序列，一般选择Poisson Correction（泊松修正）这一模型。而对于核酸序列，一般选择Kimura 2-parameter（Kimura-2参数）模型。如果对各种模型的理解并不深入，作者并不推荐初学者使用其他复杂的模型。

Bootstrap几乎是一个必须的选项。一般Bootstrap的值>70，则认为构建的进化树较为可靠。如果Bootstrap的值太低，则有可能进化树的拓扑结构有错误，进化树是不可靠的。

对于进化树的构建，如果对理论的了解并不深入，作者推荐使用缺省的参数。需要选择模型的时候（例如用NJ或者ML建树），对于蛋白序列使用Poisson Correction模型，对于核酸序列使用Kimura-2参数模型。另外需要做Bootstrap检验，当Bootstrap值过低时，所构建的进化树其拓扑结构可能存在问题。并且，一般推荐用两种不同的方法构建进化树，如果所得到的进化树类似，则结果较为可靠。

二、软件的选择

构建分子进化树相关的软件:

• ClustalX http://bips.u-strasbg.fr/fr/Documentation/ClustalX/ 图形化的多序列比对工具
• ClustalW http://www.cf.ac.uk/biosi/research/biosoft/Downloads/clustalw.html 命令行格式的多序列比对工具
• GeneDoc http://www.psc.edu/biomed/genedoc/ 多序列比对结果的美化工具
• BioEdit http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html 序列分析的综合工具
• MEGA http://www.megasoftware.net/ 图形化、集成的进化分析工具，不包括ML
• PAUP http://paup.csit.fsu.edu/ 商业软件，集成的进化分析工具
• PHYLIP http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html 免费的、集成的进化分析工具
• PHYML http://atgc.lirmm.fr/phyml/ 最快的ML建树工具
• PAML http://abacus.gene.ucl.ac.uk/software/paml.html ML建树工具
• Tree-puzzle http://www.tree-puzzle.de/ 较快的ML建树工具
• MrBayes http://mrbayes.csit.fsu.edu/ 基于贝叶斯方法的建树工具
• MAC5 http://www.agapow.net/software/mac5/ 基于贝叶斯方法的建树工具
• TreeView http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html 进化树显示工具

上面中列出了一些与构建分子进化树相关的软件构建NJ树，可以用PHYLIP（写得有点问题，例如比较慢，并且Bootstrap检验不方便）或者MEGA。MEGA是Nei开发的方法并设计的图形化的软件，使用非常方便。作者推荐MEGA软件为初学者的首选。虽然多序列比对工具ClustalW/X自带了一个NJ的建树程序，但是该程序只有p-distance模型，而且构建的树不够准确，一般不用来构建进化树。

构建MP树，最好的工具是PAUP，但该程序属于商业软件，并不对学术免费。因此，作者并不建议使用PAUP。而MEGA和PHYLIP也可以用来构建进化树。这里，作者推荐使用MEGA来构建MP树。理由是，MEGA是图形化的软件，使用方便，而PHYLIP则是命令行格式的软件，使用较为繁琐。对于近缘序列的进化树构建，MP方法几乎是最好的。

构建ML树可以使用PHYML,速度最快。或者使用Tree-puzzle,速度也较快，并且该程序做蛋白质序列的进化树效果比较好。而PAML则并不适合构建进化树。ML的模型选择是看构出的树的likelihood值，从参数少，简单的模型试起，到likelihood值最大为止。ML也可以使用PAUP或者PHYLIP来构建。这里作者推荐的工具是BioEdit。BioEdit集成了一些PHYLIP的程序，用来构建进化树。Tree-puzzle是另外一个不错的选择，不过该程序是命令行格式的，需要学习DOS命令。PHYML的不足之处是没有win32的版本，只有适用于64位的版本，因此不推荐使用。值得注意的是，构建ML树，不需要事先的多序列比对，而直接使用FASTA格式的序列即可。

贝叶斯的算法以MrBayes为代表，不过速度较慢在一般的进化树分析中较少应用，且该方法需要很多背景知识，这里不作介绍。

需要注意的几个问题是，其一，如果对核酸序列进行分析，并且是CDS编码区的核酸序列，一般需要将核酸序列分别先翻译成氨基酸序列，进行比对，然后再对应到核酸序列上。这一流程可以通过MEGA 3.0以后的版本实现。MEGA3现在允许两条核苷酸，先翻成蛋白序列比对之后再倒回去，做后续计算。其二，无论是核酸序列还是蛋白序列，一般应当先做成FASTA格式。FASTA格式的序列，第一行由符号“>”开头，后面跟着序列的名称，可以自定义，例如user1，protein1等等。将所有的FASTA格式的序列存放在同一个文件中。文件的编辑可用Windows自带的记事本工具，或者EditPlus（Google搜索可得）来操作。文件格式如图1所示：

另外，构建NJ或者MP树需要先将序列做多序列比对的处理。作者推荐使用ClustalX进行多序列比对的分析。多序列比对的结果有时需要后续处理并应用于文章中，这里作者推荐使用GeneDoc工具。而构建ML树则不需要预先的多序列比对。

因此，作者推荐的软件组合为：MEGA 3.1 + ClustalX + GeneDoc + BioEdit。

三、数据分析及结果推断

一般碰到的几类问题是：

（1）推断基因/蛋白的功能；

（2）基因/蛋白家族分类；

（3）计算基因分化的年代。

关于这方面的文献非常多，这里作者仅做简要的介绍。

推断基因/蛋白的功能，一般先用BLAST工具搜索同一物种中与不同物种的同源序列，这包括直向同源物（Ortholog）和旁系同源物（Paralog）。如何界定这两种同源物，网上有很多详细的介绍，这里不作讨论。然后得到这些同源物的序列，做成FASTA格式的文件。一般通过NJ构建进化树，并且进行Bootstrap分析所得到的结果已足够。如果序列近缘，可以再使用MP构建进化树，进行比较。如果序列较远源，则可以做ML树比较。使用两种方法得到的树，如果差别不大，并且Bootstrap总体较高，则得到的进化树较为可靠。

基因/蛋白家族分类。这方面可以细分为两个问题。一是对一个大的家族进行分类，另一个就是将特定的一个或多个基因/蛋白定位到已知的大的家族上，看看属于哪个亚家族。例如，对驱动蛋白（kinesin）超家族进行分类，属于第一个问题。而假如得到一个新的驱动蛋白的序列，想分析该序列究竟属于驱动蛋白超家族的14个亚家族中的哪一个，则属于后一个问题。这里，一般不推荐使用MP的方法。大多数的基因/蛋白家族起源较早，序列分化程度较大，相互之间较为远源。这里一般使用NJ、ME或者ML的方法。

计算基因分化的年代。这个一般需要知道物种的核苷酸替代率。常见物种的核苷酸替代率需要查找相关的文献。这里不作过多的介绍。一般对于这样的问题，序列多数是近缘的，选择NJ或者MP即可。如果使用MEGA进行分析，选项中有一项是“Gaps/Missing Data”，一般选择“Pairwise Deletion”。其他多数的选项保持缺省的参数。

四、总结

在实用中，只要方法、模型合理，建出的树都有意义，可以任意选择自己认为好一个。最重要的问题是：你需要解决什么样 的问题？如果分析的结果能够解决你现有的问题，那么，这样的分析足够了。因此，在做进化分析前，可能需要很好的考虑一下自己的问题所在，这样所作的分析才有针对性。

※※※名词解释※※※

1.FASTA

在生物信息学中，FASTA格式（又称为Pearson格式），是一种基于文本用于表示核苷酸序列或氨基酸序列的格式。在这种格式中碱基对或氨基酸用单个字母来编码，且允许在序列前添加序列名及注释。

2.MAFFT

主站：http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/

维基百科：http://en.wikipedia.org/wiki/MAFFT

3. Bootstrap（摘自百度）

即自展值，是用来检验你所计算的进化树分支可信度的。简单地讲就是把序列的位点都重排，重排后的序列再用相同的办法构树，如果原来树的分枝在重排后构的树中也出现了，就给这个分枝打上一分，如果没出现就给0分，这样经过你给定的repetitions次（至少1000次）重排构树打分后，每个分枝就都得出分值，计算机会给你换算成bootstrap值。重排的序列有很多组合，值越小说明分枝的可信度越低，最好根据数据的情况选用不同的构树方法和模型。

4.CDS序列（摘自百度）

CDS(coding sequence)序列是编码序列，是用来编码蛋白质的那段序列，是mRNA的一部分。通常外显子指的是编码蛋白序列。严格地说，外显子是指保留在初级mRNA中不被剪切掉的区域，包括5’非翻译区(5’UTR)、编码序列和3’非翻译区(3’UTR)。所以mRNA的外显子的概念应该要大于CDS序列的范畴。

问：知道了基因的mRNA，怎样通过mRNA找到它的内含子序列......

要看这个物种是不是已经全基因组测序了……
如果已经有了全基因组测序，就可以把整个mRNA序列拿去Genbank去blast（大概应该是那个RNA到DNA的，还可以试一下蛋白blast DNA的，有时候这个blast会比较准），然后把两个高同源的部分中间的部分复制粘贴下来就行了，如果需要实际拿到序列就根据两边的外显子（如果短）或者中间的部分序列（如果长）设个引物，用提取的核基因组做模板扩一下就行了。
如果没有，那就只好找一个亲缘关系比较近的、已有全基因组测序结果的物种重复一下上面的blast，然后根据中间的长度估一下扩增的条件，然后用两端的外显子设一下引物去扩增获得产物去测序，从而获得内含子序列。

本文地址：丁香通（稍作修改） http://www.biomart.cn/experiment/430/586/588/25195.htm

1.欧洲生物信息中心 http://www.ebi.ac.uk/

2.核酸和蛋白质序列分析方法汇总 

http://web.91bio.com/nucleic-acid-and-protein-sequence-analysis-methods-summary.html

3. EditPlus Text Editor http://www.editplus.com/ 

本文来自：http://yyqsniper.blog.163.com/blog/static/456678120124741435784/