核酸基因技术讨论

请问 crispr/cas9-gRNA 转染后如何筛选单克隆细胞系？

楼主收藏举报帖子创建时间: 2017-12-18 09:47 回复：5 关注量：301

构建crispr/cas9-gRNA KO 细胞系，转染完质粒后，加嘌呤霉素筛选三天了，大部分细胞死亡，剩下的应该是转染进去的，那么下一步应该怎么筛选单克隆呢？还要用加了嘌呤霉素的培养基还是换用普通的培养基呢？一般要筛选多少天呢？

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Fubio-GG 2017-12-18 15:05
#1

先检测细胞是否有敲除，在进行单克隆筛选
我訫飛鴹 2017-12-18 18:56
#2

具体应该怎么检测是否有敲除呢，假如里面有的有敲除有的没有敲除的话，能检测出来吗，关键是加药三天后细胞大部分都死了，只有很少存活下来的，也不够用来提RNA 和蛋白的啊，怎么办
zfdows 2017-12-19 13:02
#3

分选单克隆，提基因组在目的片段附近P一段测序，对比野生型基因组序列
善莫大焉YT8L 2018-02-25 20:12
#4

转染进去了，也不一定发生knock out了。楼上说的对，你应该把细胞增殖到一定的数量后，再去验证这堆细胞里面有没有发生knock out的，如果有再慢慢挑到那个对的细胞。
wenf98 2018-03-16 14:34
#5

楼上说的对，进去了也不一定起作用，将药筛下来的细胞检测下，T7E1 & 测序看下是否有突变或突变的强度，再计划是否筛选单克隆，混合克隆里可能有未突变的，突变了但未移码的，所以要挑出移码突变的单克隆才有意义

Fubio-GG 帖子创建时间: 2017-12-18 15:05

先检测细胞是否有敲除，在进行单克隆筛选

我訫飛鴹帖子创建时间: 2017-12-18 18:56

具体应该怎么检测是否有敲除呢，假如里面有的有敲除有的没有敲除的话，能检测出来吗，关键是加药三天后细胞大部分都死了，只有很少存活下来的，也不够用来提RNA 和蛋白的啊，怎么办

zfdows 帖子创建时间: 2017-12-19 13:02

分选单克隆，提基因组在目的片段附近P一段测序，对比野生型基因组序列

善莫大焉YT8L 帖子创建时间: 2018-02-25 20:12

转染进去了，也不一定发生knock out了。楼上说的对，你应该把细胞增殖到一定的数量后，再去验证这堆细胞里面有没有发生knock out的，如果有再慢慢挑到那个对的细胞。

wenf98 帖子创建时间: 2018-03-16 14:34

楼上说的对，进去了也不一定起作用，将药筛下来的细胞检测下，T7E1 & 测序看下是否有突变或突变的强度，再计划是否筛选单克隆，混合克隆里可能有未突变的，突变了但未移码的，所以要挑出移码突变的单克隆才有意义

nsp	楼主 \| 收藏 \| 举报 \| 管理 2017-12-18 09:47 浏览: 301 回复: 5 构建crispr/cas9-gRNA KO 细胞系，转染完质粒后，加嘌呤霉素筛选三天了，大部分细胞死亡，剩下的应该是转染进去的，那么下一步应该怎么筛选单克隆呢？还要用加了嘌呤霉素的培养基还是换用普通的培养基呢？一般要筛选多少天呢？
nsp	楼主 \| 收藏 \| 举报 \| 管理 2017-12-18 09:47 浏览: 301 回复: 5 构建crispr/cas9-gRNA KO 细胞系，转染完质粒后，加嘌呤霉素筛选三天了，大部分细胞死亡，剩下的应该是转染进去的，那么下一步应该怎么筛选单克隆呢？还要用加了嘌呤霉素的培养基还是换用普通的培养基呢？一般要筛选多少天呢？