T7E1法检测基因敲除引物设计问题
在做CRISPR/Cas9基因敲除实验,现在挑选完了单克隆细胞,之后马上要检测打靶效率。就是PCR敲除位点附近序列,在靶位点前后合适位置设计检测引物。小弟就是这一步骤不太明白,怎么设计这个引物。1,是突变的和野生的分别设计一对儿上下游引物吗?2.上下游引物位置的选择是哪里?比如我想,敲掉的基因是“ABCDEFGH”,我在B段设计的gRNA退火形成双链DNA片段,然后连接到px458质粒,转化测序转染挑单克隆。那么我用T7E1法设计敲除位点附近序列的引物要怎么设计?请各位大神不吝赐教。
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david_xmu 2017-06-13 22:41#2
LordJonSnow
在做CRISPR/Cas9基因敲除实验,现在挑选完了单克隆细胞,之后马上要检测打靶效率。就是PCR敲除位点附近序列,在靶位点前后合适位置设计检测引物。小弟就是这一步骤不太明白,怎么设计这个引物。1,是突变的和野生的分别设计一对儿上下游引物吗?2.上下游引物位置的选择是哪里?比如我想,敲掉的基因是“ABCDEFGH”,我在B段设计的gRNA退火形成双链DNA片段,然后连接到px458质粒,转化测序转染挑单克隆。那么我用T7E1法设计敲除位点附近序列的引物要怎么设计?请各位大神不吝赐教。
以B为中心,上下游各+300bp左右分别设计上游引物和下游引物序列,把PCR出来的wildtype的片段和你挑取的单克隆的片段混合后进行退火,然后用T7E1去切,如果在B的位置附近发生了indel mutation,那么T7E1的酶切的结果应该是出现一条短的300bp左右的片段,如果没有mutation,那么就是600多bp的大片段
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淚1123 2017-06-19 10:49#3
你好!我也要做细胞的敲除,我是新手,对于细胞敲除很多地方不是很明白,想跟你请教请教。首先是含敲除靶位点的引物是怎样的,我知道将敲除的引物退火后形成双链再连接到质粒上,现在就是不知道连接到质粒上的这个正反向引物的序列是怎样的,你可否跟我说说,不胜感激!
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lucifei 2018-01-08 16:16#4
LordJonSnow
在做CRISPR/Cas9基因敲除实验,现在挑选完了单克隆细胞,之后马上要检测打靶效率。就是PCR敲除位点附近序列,在靶位点前后合适位置设计检测引物。小弟就是这一步骤不太明白,怎么设计这个引物。1,是突变的和野生的分别设计一对儿上下游引物吗?2.上下游引物位置的选择是哪里?比如我想,敲掉的基因是“ABCDEFGH”,我在B段设计的gRNA退火形成双链DNA片段,然后连接到px458质粒,转化测序转染挑单克隆。那么我用T7E1法设计敲除位点附近序列的引物要怎么设计?请各位大神不吝赐教。
你好,小弟我目前也在做CRISPR,刚构建完几条sgRNA-px459-puro,想筛下哪条的打靶效率最好。最近想把构建好的sgRNA转染293T,然后提DNA,用T7E1法。想问下转染293T到提DNA的过程中,转染多久后用嘌呤霉素处理?再多久后提取DNA? 然后还有个问题就是,筛puro对293T细胞的最小致死浓度,我查了一些资料,对于筛选时间有多种说法(有些3天,7天或2周),这个到底怎么选?希望得到你的指点,谢谢!
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wenf98 2018-03-16 15:40#5
普通ko,靶点2端不对称设计引物,一般200--300,突变体和WT用同样引物就行,gRNA活性很重要,找公司直接买预筛选的gRNA靶点载体,省去很多步骤节省时间。上海吉荧有这个载体,供上面几位参考
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wt ko用同样的引物。我记得韩春雨的文章里面就有。或者你可以参考t7e1的说明书。