【建议】毕赤酵母--相关问题-1
近期，常有人问我关于酵母表达的问题，有些人 做了表达，跑SDS-PAGE没条带，就非常纠结。
下面我简单介绍下：我自己的认识。
常用到的毕赤酵母菌x-33，GS115，KM71，SMD1168，载体PPICZB，pPICZaA,pPIC9K,pPGAPZaA。
1、在做实验前，先查阅前人的做法，然后确定自己的方案，选好载体和受体菌，这个影响挺大，前阵子，朋友表达一种蛋白用X33，怎么都没蛋白，后来就换了KM71，就有蛋白表达出来，这里可能原因是，X33是甲醇利用型，而KM71是甲醇缓慢利用型，所以甲醇利用太快，是蛋白来不及表达或表达一部分等。
2、在做表达前，首先要对自己得到的克隆菌株进行基因组扩增目的基因，如果没有扩增出来，就不要往下再表达了，因为没有基因是肯定表达不出来的。
3、做酵母表达时，如果是胞外表达，在跑SDS-PAGE电泳时，除了要跑上清液，还要把菌液也跑下，有时候，蛋白在分泌的时候可能挂在膜上，分泌不出来，这个我也碰到过，最后就是在胞内分泌出来。
4、每次表达后的蛋白酶液，要浓缩，并除盐离子，如果表达液里还是没有蛋白，这个时候就要考虑更换受体菌，先更换受体菌，如果还是没有蛋白表达，就再更换载体。直到有蛋白为止。
5、我建议在表达蛋白时，一定要设计一个蛋白带标签的，这样表达结束，如果看不见蛋白，就用WB等方法验证基因的表达情况。
6、还有人问我，表达不出来可能是自己的挑选克隆少，于是要挑选100个，我觉得这是不妥的，通常来讲你如果挑了10单菌落，培养后还没表达，应该就可以断定这个蛋白是很难表达了，这时候就要考虑更换受体菌或载体。
以上只是我最近，从不少的问题上，总结出自己的经验，不知道是否有用
下面我简单介绍下：我自己的认识。
常用到的毕赤酵母菌x-33，GS115，KM71，SMD1168，载体PPICZB，pPICZaA,pPIC9K,pPGAPZaA。
1、在做实验前，先查阅前人的做法，然后确定自己的方案，选好载体和受体菌，这个影响挺大，前阵子，朋友表达一种蛋白用X33，怎么都没蛋白，后来就换了KM71，就有蛋白表达出来，这里可能原因是，X33是甲醇利用型，而KM71是甲醇缓慢利用型，所以甲醇利用太快，是蛋白来不及表达或表达一部分等。
2、在做表达前，首先要对自己得到的克隆菌株进行基因组扩增目的基因，如果没有扩增出来，就不要往下再表达了，因为没有基因是肯定表达不出来的。
3、做酵母表达时，如果是胞外表达，在跑SDS-PAGE电泳时，除了要跑上清液，还要把菌液也跑下，有时候，蛋白在分泌的时候可能挂在膜上，分泌不出来，这个我也碰到过，最后就是在胞内分泌出来。
4、每次表达后的蛋白酶液，要浓缩，并除盐离子，如果表达液里还是没有蛋白，这个时候就要考虑更换受体菌，先更换受体菌，如果还是没有蛋白表达，就再更换载体。直到有蛋白为止。
5、我建议在表达蛋白时，一定要设计一个蛋白带标签的，这样表达结束，如果看不见蛋白，就用WB等方法验证基因的表达情况。
6、还有人问我，表达不出来可能是自己的挑选克隆少，于是要挑选100个，我觉得这是不妥的，通常来讲你如果挑了10单菌落，培养后还没表达，应该就可以断定这个蛋白是很难表达了，这时候就要考虑更换受体菌或载体。
以上只是我最近，从不少的问题上，总结出自己的经验，不知道是否有用
版主blowapc留言:
请不要留联系方式，谢谢~~
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fayesunshine 2018-03-14 21:57#2您好，我用的pPIC9K的载体转毕赤酵母GS115，在胞外没有检测到蛋白，反而在胞内检测到目的蛋白了，但是我需要它分泌到胞外，还有办法挽救吗？
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您好，我也做酵母表达，用的是GS115，我挑单个菌落培养提基因组后，有AOX引物检测，出现两条带，我把带有目的基因条带割胶后克隆测序，发现正确导入了。但我用甘油保存的菌夜划板，6天了，尽然没有单个菌落出现，就是不长酵母，我的板是YPD+Zeocin，没有加山梨醇，没找到原因，哪位大侠指导一下？不胜感激。