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剑藏鞘 2018-03-13 17:02#2你这是起的太晚了，还没有达到平台期是研究结束了，第一你可以试试45个循环可能会有平台期，满足你没有平台期的想法，但是对实验没有任何意义，第二重新引物或者使用新的模板（基于你的内参）
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dxy_1ex6xfn3 2018-03-13 19:00#3
剑藏鞘
你这是起的太晚了，还没有达到平台期是研究结束了，第一你可以试试45个循环可能会有平台期，满足你没有平台期的想法，但是对实验没有任何意义，第二重新引物或者使用新的模板（基于你的内参）
后来我把循环设成55了看看到底在哪，发现在45时才开始，我用的标准质粒，根据引物设计的，会不会是设计问题？不是设计问题的话，一般引物和模板浓度多少是比较常用的？麻烦指导一下
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就让往事随风灬 2018-03-13 20:08#4模板浓度太低了，35个ct，只有几十个拷贝的模板量，还是40个循环，肯定没有平台期啊。引物浓度200-400nM，模板浓度看你具体做什么，都可以，只要不是几个拷贝就行
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就让往事随风灬 2018-03-13 20:11#5
不知道你用的什么质粒，我们公司做的质粒，母管都是10的10次拷贝的级别，而且你做定量，应该先从高浓度的模板开始做
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dxy_1ex6xfn3 2018-03-13 20:31#6
就让往事随风灬
模板浓度太低了，35个ct，只有几十个拷贝的模板量，还是40个循环，肯定没有平台期啊。引物浓度200-400nM，模板浓度看你具体做什么，都可以，只要不是几个拷贝就行引物是按照天根的试剂盒加的，浓度10uM取0.6ul加在20ul的体系里，如果是这个20ul的体系，100uM的质粒加多少合适？网上查资料都说是ng但是从外面公司做的质粒母液标签就写着加nmol：6.9 Tm:70.0 OD：2.0 Add69ul buffer for 100uM。所以加了69ul的水稀释到100uM了。这样做对吗？
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就让往事随风灬 2018-03-13 21:57#7
你这个引物终浓度是300nM,没问题，可以用。但是你这个质粒的标签，一看就是引物的。我们公司合成的质粒都是这样的，都是5 ug，然后自己加TE，都是ug/ul为单位，你再问问你合成的公司吧。这个质粒到底是怎么回事
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dxy_1ex6xfn3 2018-03-13 22:41#8
就让往事随风灬
你这个引物终浓度是300nM,没问题，可以用。但是你这个质粒的标签，一看就是引物的。我们公司合成的质粒都是这样的，都是5 ug，然后自己加TE，都是ug/ul为单位，你再问问你合成的公司吧。这个质粒到底是怎么回事
这样啊，非常感谢，明天我打电话问问
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剑藏鞘 2018-03-14 09:22#9
dxy_1ex6xfn3
后来我把循环设成55了看看到底在哪，发现在45时才开始，我用的标准质粒，根据引物设计的，会不会是设计问题？不是设计问题的话，一般引物和模板浓度多少是比较常用的？麻烦指
你的标准质粒拷贝数是多少ng/ul？或者是多少个copies/ul
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dxy_1ex6xfn3 2018-03-14 13:03#10
剑藏鞘
你的标准质粒拷贝数是多少ng/ul？或者是多少个copies/ul
今天我给他们公司打电话了，他们做错东西了，管子上标签是引物那种稀释后100uM的单位。但是老师我还有几点不明白的想请教一下，他们东西弄错了，为什么增加循环数后能出现扩增曲线，融解曲线也显示出单峰了。我想根据融解曲线单峰做定性试验，根据引物定制了质粒标准品，做出的融解曲线能否做以后样品的标准来证明样品里有目的基因？
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把模板稀释了十倍，循环次数增加了还是这样，大神快出现啊