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【求助】LPS诱导RAW264.7产生NO

楼主收藏举报帖子创建时间: 2011-09-05 12:35 回复：22 关注量：224

这个模型做了很多次都做不出来，OD值空白值一般为0.05~0.06，加了LPS以后的OD值一般在0.07~0.09.没有明显差异。不知道有没有前辈做成功过，可以指点迷津呢？
我的RAW细胞是从别的实验室拿的，培养条件是1640+10%FBS（国产，未灭活），pH=8，细胞状态应该还不错，触角较少，不漂，一般隔天传代。
实验步骤是：以3万/孔的密度点96孔板（3k、1万、4万、6万、8万都做过），24h后加LPS（现用现配，以1640+10%FBS溶解，3%FBS和无FBS也都做过），处理24h后用碧云天的Griess法试剂盒在540nm吸光度下，用全波长酶标仪测。

请大家看看有没有什么原因导致NO产生不明显的。

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静镆 2011-09-05 20:39
#1

我做了三个月这方面的实验，我的空白对照组OD在0.7左右，加LPS刺激后OD在1.2左右。是正常的。不知道是不是LPS的原因，我用的终浓度是1ug/ml,效果挺好的。根据师兄的经验，做这个实验，细胞密度不要过大，60%-70%就可以了，密度过大不利于LPS刺激细胞
静镆 2011-09-05 20:39
#2

我做了三个月这方面的实验，我的空白对照组OD在0.7左右，加LPS刺激后OD在1.2左右。是正常的。不知道是不是LPS的原因，我用的终浓度是1ug/ml,效果挺好的。根据师兄的经验，做这个实验，细胞密度不要过大，60%-70%就可以了，密度过大不利于LPS刺激细胞
smiling_ran 2011-09-06 13:53
#3

静镆
我做了三个月这方面的实验，我的空白对照组OD在0.7左右，加LPS刺激后OD在1.2左右。是正常的。不知道是不是LPS的原因，我用的终浓度是1ug/ml,效果挺好的。根据师兄的经验，做这个实验，细胞密度不要过大，60%-70%就可以了，密度过大不利于LPS刺激细胞
谢谢这位战友的回复！
是细胞密度的原因么有可能因为我一般都是铺3万/孔，长12h以后基本就很满了，请问你的铺板密度是多少呢？3k/孔，长12h后给药么？
我的LPS是sigma原装的，E.coli 055：B5。请问你用的LPS是什么型号的呢？
echo森木林 2011-09-06 18:45
#4

我也用的碧云天的试剂盒，上清和细胞内的都试过，从96孔板做到整个培养瓶，都没有检测出来，最后我这个实验就是无疾而终。
话说，我个人觉得碧云天的这个NO试剂盒敏感度太低，说明书推荐的标准曲线，1uM、2uM、5uM、10uM这几个点我都在基线水平……
smiling_ran 2011-09-06 18:52
#5

echo森木林
我也用的碧云天的试剂盒，上清和细胞内的都试过，从96孔板做到整个培养瓶，都没有检测出来，最后我这个实验就是无疾而终。
话说，我个人觉得碧云天的这个NO试剂盒敏感度太低，说明书推荐的标准曲线，1uM、2uM、5uM、10uM这几个点我都在基线水平……
又做了一次预试。这一次细胞形态改变十分明显，触角长得特别多，但是用碧云天的盒子就是测不出来！可是我的标曲能做出来2个9耶……所以也不好怪试剂盒吧……
chenli2005nj 2011-09-06 20:03
#6

我也在做这个模型，也是做不出来，不知道是实验条件哪里不对呢，还是NO产生量太少了，又或者是用的试剂盒有问题呢？
求高手指点一下
xiaoxiurong 2012-03-07 19:40
#7

请问碧云天标准曲线是怎样制作的？我目前正在做，但是效果不好，另外加完Griess试剂后溶液是什么颜色？标准曲线制作的颜色？
萤之光芒 2012-04-09 13:34
#8

请问各位大神有没有人做用LPS刺激RAW264.7测IL-8的表达水平的？我用5ug/ml的LPS刺激巨噬细胞，LPS的表达量跟阴性对照相差不大，不知道是不是细胞的问题，恳请各位指点一下小弟。
erin若水 2013-04-08 09:43
#9

我的情况和楼主一样，不知楼主现在做得怎么样了，求经验，急！！！
mokou85 2013-04-13 13:53
#10

我做的不是LPS，是另外一种多糖，我的效果很明显啊，我的Griess试剂还是自己配置的的，但是我的空白组也是检测不到NO，而对照组特别明显。但是MTT检测细胞活力，加药组的吸光度却不如空白组。