T7E1法检测基因敲除引物设计问题
在做CRISPR/Cas9基因敲除实验，现在挑选完了单克隆细胞，之后马上要检测打靶效率。就是PCR敲除位点附近序列，在靶位点前后合适位置设计检测引物。小弟就是这一步骤不太明白，怎么设计这个引物。1，是突变的和野生的分别设计一对儿上下游引物吗？2.上下游引物位置的选择是哪里？比如我想，敲掉的基因是“ABCDEFGH”，我在B段设计的gRNA退火形成双链DNA片段，然后连接到px458质粒，转化测序转染挑单克隆。那么我用T7E1法设计敲除位点附近序列的引物要怎么设计？请各位大神不吝赐教。
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david_xmu 2017-06-13 22:41#2LordJonSnow
在做CRISPR/Cas9基因敲除实验，现在挑选完了单克隆细胞，之后马上要检测打靶效率。就是PCR敲除位点附近序列，在靶位点前后合适位置设计检测引物。小弟就是这一步骤不太明白，怎么设计这个引物。1，是突变的和野生的分别设计一对儿上下游引物吗？2.上下游引物位置的选择是哪里？比如我想，敲掉的基因是“ABCDEFGH”，我在B段设计的gRNA退火形成双链DNA片段，然后连接到px458质粒，转化测序转染挑单克隆。那么我用T7E1法设计敲除位点附近序列的引物要怎么设计？请各位大神不吝赐教。
以B为中心，上下游各+300bp左右分别设计上游引物和下游引物序列，把PCR出来的wildtype的片段和你挑取的单克隆的片段混合后进行退火，然后用T7E1去切，如果在B的位置附近发生了indel mutation，那么T7E1的酶切的结果应该是出现一条短的300bp左右的片段，如果没有mutation，那么就是600多bp的大片段
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淚1123 2017-06-19 10:49#3你好！我也要做细胞的敲除，我是新手，对于细胞敲除很多地方不是很明白，想跟你请教请教。首先是含敲除靶位点的引物是怎样的，我知道将敲除的引物退火后形成双链再连接到质粒上，现在就是不知道连接到质粒上的这个正反向引物的序列是怎样的，你可否跟我说说，不胜感激！
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lucifei 2018-01-08 16:16#4LordJonSnow
在做CRISPR/Cas9基因敲除实验，现在挑选完了单克隆细胞，之后马上要检测打靶效率。就是PCR敲除位点附近序列，在靶位点前后合适位置设计检测引物。小弟就是这一步骤不太明白，怎么设计这个引物。1，是突变的和野生的分别设计一对儿上下游引物吗？2.上下游引物位置的选择是哪里？比如我想，敲掉的基因是“ABCDEFGH”，我在B段设计的gRNA退火形成双链DNA片段，然后连接到px458质粒，转化测序转染挑单克隆。那么我用T7E1法设计敲除位点附近序列的引物要怎么设计？请各位大神不吝赐教。
你好，小弟我目前也在做CRISPR，刚构建完几条sgRNA-px459-puro，想筛下哪条的打靶效率最好。最近想把构建好的sgRNA转染293T，然后提DNA，用T7E1法。想问下转染293T到提DNA的过程中，转染多久后用嘌呤霉素处理？再多久后提取DNA？ 然后还有个问题就是，筛puro对293T细胞的最小致死浓度，我查了一些资料，对于筛选时间有多种说法（有些3天，7天或2周），这个到底怎么选？希望得到你的指点，谢谢！
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wenf98 2018-03-16 15:40#5普通ko，靶点2端不对称设计引物，一般200--300，突变体和WT用同样引物就行，gRNA活性很重要，找公司直接买预筛选的gRNA靶点载体,省去很多步骤节省时间。上海吉荧有这个载体，供上面几位参考
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wt ko用同样的引物。我记得韩春雨的文章里面就有。或者你可以参考t7e1的说明书。