倾斜的显微镜技术更好地揭示了蛋白质结构

在冷冻EM实验期间将蛋白质样品置于电子显微镜下的常规方法在获得蛋白质结构的最佳图像时可能会失败。根据Salk领导的一项新研究，在某些情况下，倾斜一片冷冻蛋白质 - 在显微镜下放置10到50度 - 提供更高质量的数据，并可以更好地了解各种疾病。科学家Dmitry Lyumkis。

“人们之前曾试图实施倾斜，但存在很多挑战，”Salk研究所的Helmsley-Salk研究员，新作品的高级作者Lyumkis在7月3日出版的“自然方法”杂志上说。“我们用新的方法消除了许多这些问题。”

Cryo-EM或低温电子显微镜是透射电子显微镜的一种形式，其中样品在显微镜下成像之前快速冷却至低于冰点。与通常用于确定蛋白质结构的其他方法不同，冷冻EM使蛋白质保留在其成像的天然构象中，这可以揭示有关结构的新信息。了解蛋白质的结构是开发新的疾病治疗方法的重要一步，例如艾滋病病毒。

长期以来，研究人员一直认为，蛋白质在整个冷冻网格中采用随机构象，为冷冻EM实验做好准备，这意味着通过拍摄足够的图像，研究人员可以从所有成像方向整合出蛋白质形状的完整3D图像。但是对于许多蛋白质来说，这种方法似乎不足，而且部分蛋白质的结构仍然缺失。

“研究人员开始认为冷冻EM网格上的蛋白质毕竟不采用随机构象，而是以优选方向粘在样本网格的顶部或底部，”Lyumkis说。“因此，我们可能无法全面了解蛋白质的结构。更重要的是，这种行为可以完全禁止选择蛋白质样品的结构测定。”

为了理解这个问题，想象一下，试着看看十几个锡罐的阴影来弄清楚它们的形状，但只能看到圆圈，因为所有的罐头都是直立的。通过制作光束或电子束，在低温EM的情况下，以一定角度撞击样品，您将能够更好地看到真实的形状。

当研究人员过去曾试图在显微镜下倾斜样品时，它们受到分辨率不佳的限制：一个角度意味着电子束必须穿过更厚的网格。当样本倾斜时，样本也更有可能在冻结网格内移动，从而模糊了数据。从技术上讲，分析倾斜样品的数据也更具挑战性，因为低温EM方法的设计假设含有蛋白质的网格始终与显微镜的距离相同。

为了应对这些挑战，Lyumkis和他的同事改变了用于创建低温EM网格的材料，记录了他们的数据电影而不是静态图像，并开发了新的计算方法来分析信息。

当他们测试流感血凝素蛋白的新方法时，该团队发现倾斜样本给出了更完整的数据集，这是一种众所周知的硬蛋白，可以用冷冻EM来表征。当蛋白质样品是扁平的时，典型的算法会为蛋白质引入假阳性形状，而实验数据则没有这种形状。当它倾斜时，情况并非如此。

“由于我们倾斜时数据采集的几何形状，我们填充了更多的数据表征分子，让我们更完整地了解蛋白质的形状”Lyumkis说。

Lyumkis和他的团队开发的算法 - 包括分析低温EM实验是否会引入不良数据的方法，以及解释倾斜实验的方法 - 现在已公开可用。他们希望其他研究人员开始使用它们，并且它成为低温EM结构验证的标准度量标准(因为大多数实验得出的结构在不同程度上都会丢失信息)。

“我们现在关注的一个想法是，数据收集是应该总是以倾斜而不是传统的方式进行，”Lyumkis说。“它不会受到伤害，它应该会有所帮助。”