抗CRISPR蛋白降低CRISPR-Cas9的脱靶副作用

CRISPR-Cas9基因编辑基于为保护自身免受病毒侵害而开发的策略细菌。现在的研究表明，抗衡病毒产生的抗抑制蛋白被称为抗CRISPRs，可用于改进CRISPR-Cas9作为基因治疗工具，减少可能引起不良副作用的脱靶基因编辑。

本周在“科学进展”杂志网络版上发表的一项研究表明，加州大学伯克利分校和加州大学旧金山分校的研究人员表示，最近发现的抗CRISPR蛋白质可以将脱靶效应降低四倍，就像杀死开关一样CRISPR-Cas9完成其工作后。

该研究表明，一种名为AcrIIA4的特异性抗CRISPR蛋白质降低了CRISPR-Cas9分子的脱靶效应的四倍，该分子使用指导RNA来发现，剪切和替换导致镰状细胞病的突变血红蛋白基因。它没有显着减少所需的目标基因编辑。

“由于脱靶基因编辑，可能会出现意想不到的突变，但我们的论文与许多其他人一样 - 表明可以调节脱靶效应，并且不像人们想象的那么严重，”加州大学伯克利分校博士后研究员Jiyung说。 Jenny Shin，来自Innovative Genomics Institute的Jacob Corn实验室，也是该论文的三位首批作者之一。

在她对人体细胞培养的实验中，Shin发现交付CRISPR-Cas9然后几小时后，抗​​CRISPR蛋白，是减少脱靶效应的最有效方法。蛋白质模仿DNA，在Cas9上闪烁，Cas9是实际切割双链DNA的酶，可防止进一步切割。

“即使经过6个小时的有效CRISPR，插入抗-TCR将目标效应降低两倍以上，与目标效应相比，”Shin说。“治疗上，你可以先用CRISPR治疗患者，然后再用抗CRISPR治疗，减少脱靶效应。”

发现AcrIIA4的研究员，加州大学旧金山分校的Joseph Bondy-Denomy预测这些抗CRISPR蛋白质成为CRISPR基因治疗的标准部分，与CRISPR-Cas9一起在固定的一段时间后禁用基因编辑以防止随机关闭 - 切割目标。

“这种Cas9抑制剂可以编码在与Cas9相同的DNA上，例如，精确定时在基因编辑完成后关闭Cas9，而不是让Cas9在细胞中停留并冒着脱靶效应，”Bondy说。 -Denomy，也是该论文的共同作者。

抗CRISPR结合

该团队包括了CRISPR-Cas9基因编辑发明人之一Jennifer Doudna实验室的研究人员，他们确定了抗CRISPR蛋白如何与CRISPR-Cas9复合物结合。使用低温电子显微镜，他们发现抗CRISPR基本上模仿DNA，诱使CRISPR-Cas9与其结合，然后永不放弃。

CRISPR抑制剂靶向Cas9蛋白上的一个斑点，这对Cas9的功能至关重要，当它被抗CRISPR结合时，它不能用于切割DNA。

去年，Bondy-Denomy报道发现四种抗CRISPR蛋白被攻击病毒用于灭活细菌单核细胞增生李斯特氏菌中发现的Cas9蛋白的版本。其中两种也抑制了研究人员最常使用的Cas9蛋白，后者改编自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)，被称为SpyCas9。另一个团队发现了另外三种抗CRISPR蛋白，这些蛋白可以对抗一种不同但有前景的Cas9蛋白，这种蛋白适用于脑膜炎奈瑟氏球菌。

目前的研究观察了来自李斯特菌的一种蛋白质AcrIIA4对装载有导向RNA的SpyCas9的影响，所述导向RNA包含在互补DNA上以进行结合和切割。

加州大学伯克利分校和其他地方的研究表明，CRISPR-Cas9不断对细胞DNA修复系统进行研究：随着酶在其靶位点切割，细胞修复DNA，CRISPR-Cas9再次切割，重复这种恶性循环直至出现突变在防止酶结合的DNA中，此时CRISPR-Cas9分子继续移动以找到另一个结合位点。

目前来自Corn和Doudna实验室的工作表明，在Cas9成功编辑靶基因后添加抗CRISPR可以防止对基因组其他部分的意外损害。

“将Cas9基因编辑关闭的能力与开启它的能力同样重要，”IGI生物医学科学主任，加州大学伯克利分校和分子与细胞生物学辅助教授兼玉说。“想象一下，如果你的电动剃须刀没有开关!对于最终的治疗应用，能够精确控制基因编辑活动的时间和地点至关重要。抗CRISPR蛋白质提供了完全关闭Cas9的机会。微调它的活动。“

“Jenny的数据表明，有一个理想的时间窗口可让Cas9完成工作，然后在经过一段时间后将其关闭，”Bondy-Denomy说。“我们实际上可以使用抗CRISPR蛋白质作为工具来确定那个时间窗口是什么，也就是说，对于任何一种具有任何一种指导RNA序列的细胞类型，我们希望Cas9在细胞中活跃多久。”