驱除真菌的耐药性

白色念珠菌是一种臭名昭着的人类真菌病原体，可引起鹅口疮和严重的全身性感染。机会性白色念珠菌真菌，通常在人体皮肤和肠道的正常菌群中不显眼地生活，可以从其无害的隐形模式转变为侵袭性病原体，特别是在免疫系统已经受到已有疾病或严厉药物治疗影响的人群中。 。它们还可以在医疗设备上形成生物膜，例如人体内的导管和支架，导致感染，有时甚至死亡。免疫和生物膜结合形式的病原体所构成的威胁在不断增长，因为有毒的白色念珠菌菌株对可用于治疗它们的少数药物越来越具有抗性。

微生物学家在努力抗击白色念珠菌的耐药性和生物膜形成方面面临着巨大的困难。每个白色念珠菌微生物是“二倍体”生物，因为它通常包含其整个基因组的两个拷贝和其中编码的所有基因。然而，为了理解特定基因的作用，研究人员需要能够同时删除这两个拷贝，使他们能够观察到基因完全缺失的影响，这对白色念珠菌来说是一个艰难的挑战。此外，基因在许多过程中经常发挥非常相似且有时多余的作用，包括耐药性和生物膜形成，这意味着需要删除一个以上的基因以鉴定那些功能相关的基因。

为了解决白色念珠菌中的基因缺失挑战，由哈佛大学Wyss生物启发工程研究所的两名核心教员James Collinsand George Church领导的合作团队开发了基于CRISPR-Cas9的“基因驱动”平台，以创建二倍体可以有效删除两种基因拷贝的病原体菌株。该技术可能会引导人们更好地了解耐药性和生物膜形成机制，并且通过未来的研究，它可以帮助确定新的药物靶点和联合疗法。该研究发表在Nature Microbiology上。

该团队利用了最近发现的非常罕见的“单倍体”形式的白色念珠菌，与其他真菌一样，只含有一组染色体，每个基因有一个拷贝，但它们可以交配以轻易地形成二倍体形式。“我们使用了单倍体白色念珠菌菌株，用我们之前开发的'基因驱动'取代了我们想要消除的基因，并根据白色念珠菌的特定生物学进行了调整。交配后，这些”自私的遗传元素“继续取代这种基因在二倍体真菌中的正常拷贝，“哈佛医学院遗传学教授，哈佛大学和麻省理工学院健康科学与技术学院教授，​​博士说。“

新的基因驱动方法基于CRISPR-Cas9系统，其中DNA切割Cas9酶通过两种所谓的指导RNA(gRNA)靶向位于单倍体白色念珠菌真菌中基因侧翼的两个区域。在切下靶基因序列后，将表达所有Cas9和gRNA组分的工程化基因驱动盒插入其位置。当两个单倍体真菌交配形成二倍体后代时，基因驱动也将替代另一个染色体中的基因对应物，完全有效地从生物体中删除原始形式。

通过应用他们的基因缺失方法，该团队能够识别基因的组合，这些基因在抗拒某些药物或触发生物膜形成方面起协同作用。“例如，删除两个外排泵编码基因CDR1和CDR2，或TPO3和CDR2，使白色念珠菌对氟康唑和其他抗真菌药物高度敏感，这表明同时靶向两种机制有助于克服耐药性，“柯林斯团队的博士后研究员丽贝卡夏皮罗博士说。夏皮罗与亚历杭德罗·查韦斯博士合作，作为该出版物的首批合着者。查韦斯是前博士后研究员，曾与教会和柯林斯合作过;他现在是纽约哥伦比亚大学的助理教授。“在生物膜形成中我们还发现，ALS3粘附因子基因的缺失与其他几种粘附因子基因的丧失协同作用，这使其成为生物膜粘附的高度互联中心，也是进一步探索的有趣候选者。

该研究为了解白色念珠菌的发病机制和耐药性的困难领域提供了新的进展。“我们现在可以更好地处理构成白色念珠菌毒力的遗传网络如何组织，看看它们如何应对特定的环境和药物扰动，从而发现新的脆弱性，将来可能导致新药目标和联合疗法，“柯林斯博士说，他也是麻省理工学院(麻省理工学院)医学工程和科学的Termeer教授，麻省理工学院的生物工程教授。“而且，我们的基因驱动力阵列平台可以作为其他真菌病原体类似方法的蓝图，例如新出现的念珠菌，它具有高度耐药性，已被疾病控制和预防中心标记为威胁。

“这两个Wyss研究所的使能技术平台，吉姆柯林斯和乔治教会的教师领导之间的这种共生合作，引发了对这种传染性真菌病原体的生物学以及它如何产生抗性的重要新见解，此外还开辟了一个全新的设计更有效的抗真菌疗法的途径，“Wyss研究所创始主任Donald Ingber，医学博士，博士，同时也是HMS血管生物学的Judah Folkman教授和波士顿儿童医院的血管生物学项目，以及SEAS生物工程教授。