基因编辑方法产生完美的多能干细胞双胞胎

由Knut Woltjen博士领导的研究人员报告了一种新的基因编辑方法，该方法可以绝对精确地修饰人类基因组中的单个DNA碱基。该技术在Nature Communications中有所描述，其独特之处在于它通过设计指导细胞自身的修复机制，提供成对的遗传匹配细胞用于研究与疾病相关的突变。

DNA中的单个突变(称为单核苷酸多态性 - 或简称SNP)是人类基因组中最常见的变异类型。已知超过1000万个SNP，其中许多与阿尔茨海默氏症，心脏病和糖尿病等疾病有关。为了解SNP在遗传性疾病中的作用，京都大学iPS细胞研究和应用中心(CiRA)的科学家们从患者捐赠者那里创造了诱导性多能干细胞。

iPS细胞保留供体的遗传组成，并且可以转化为体内的任何细胞类型。通过这种方式，可以在实验室中创建和观察来自组织(例如大脑，心脏或胰腺)的细胞，从而在开始临床试验之前能够安全地测试新的疾病治疗。

证明SNP引起疾病需要与遗传匹配或同基因iPS细胞进行非常严格的比较。理想细胞是研究人员描述的同基因“双胞胎”，其基因组仅相差一个SNP的细胞。然而，该研究的共同第一作者Shin-Il Kim博士表示，创造这对双胞胎并非易事。

“通常，我们需要添加抗生素抗性基因以及SNP以克服低效率。由于这增加了基因组的另一个变化，我们还需要一种方法来消除它。”

为了制造同基因双胞胎，Woltjen实验室开发了新的基因组编辑技术，该技术可插入SNP修饰以及荧光报告基因，该基因可作为检测修饰细胞的信号。他们还在报告基因的左侧和右侧设计了一个短的重复DNA序列，称为微同源，以及CRISPR的独特靶位点，CRISPR是一种切割DNA的酶。

这些特征允许研究人员利用细胞内源性DNA修复系统称为微同源介导的末端连接(MMEJ)，以精确去除报告基因。MMEJ去除荧光报告基因，仅留下修饰的SNP。通过将突变SNP安排在一个微观同源中并将正常SNP安排在另一个微生物学中，该方法有效地产生同基因双胞胎。

CiRA副教授Knut Woltjen博士称新的基因编辑方法为MhAX，或称为Microhomology-Assisted eXcision。Woltjen的灵感来自观察自然发生的MMEJ修复以应对DNA损伤。

“为了使MhAX发挥作用，我们复制已经存在于基因组中的DNA序列。然后让细胞解决这种重复。同时，细胞决定修复后哪些SNP将保留，”他说。“一项实验产生了全谱的可能SNP基因型。”

与广岛大学的Takashi Yamamoto博士和庆应义塾大学的Tomoyoshi Soga博士合作，Woltjen实验室使用MhAX分别在HPRT和APRT基因中创建SNP，这些基因与痛风和肾脏疾病有关。

生化分析显示具有HPRT突变体SNP的细胞具有与患者相似的代谢改变，而在相同实验中衍生的同基因双胞胎对照细胞是正常的。APRT * J突变常见于日本急性肾功能衰竭患者群体中，证明了MhAX的高效率，因为两个基因拷贝(一个来自母亲，一个来自父亲)需要基因编辑来研究突变的影响。

Woltjen的实验室已经开始应用他们的方法来创建和纠正与其他疾病相关的基因中的SNP。他们与日本和加拿大的研究人员合作，正在调查青少年患者严重糖尿病的遗传原因。

目前正在进行使用胚胎干细胞的糖尿病临床试验，但需要慢性免疫抑制。对患者自身iPS细胞进行基因校正可能会导致产生胰岛素的健康胰腺细胞的来源，移植后排斥的可能性降低。

“我们的目标是产生基因编辑技术，提高我们对疾病机制的理解，并最终导致治疗，”Woltjen说，“我们相信MhAX将在当前的人类疾病研究中具有广泛的适用性。”