CRISPR基因编辑器通常不含RNA

CRISPR基础编辑应该是简约的。它们避免造成像双链断裂那样极端的任何东西，并且它们将基因组活性局限于单核苷酸变化 - 合理的靶向变化。然而，在马萨诸塞州综合医院(MGH)的科学家们报告说，CRISPR基础编辑可以沉迷于肆意行为。这些科学家，由哈佛医学院病理学教授，医学博士，医学博士J. Keith Joung和Ann Heriswood MGH研究学者领导，他说当CRISPR编辑在野外散步时，他们可能会在整个过程中这样做。转录组，留下痕迹标记成千上万的脱靶编辑。

“大多数关于脱靶基因编辑的研究都集中在DNA上，但我们发现这种技术也可以诱导大量的RNA改变，”Joung说。“这一令人惊讶的发现表明，在考虑细胞中基础编辑的无意识脱靶效应时，需要考虑的不仅仅是遗传改变。我们还展示了通过创建选择性地减少脱靶RNA编辑同时保留预期的靶向DNA活性的变体来减少这些影响的可行性。“

Joung是4月17日出版于“自然”杂志上的一篇论文的高级作者(“由CRISPR指导的DNA基因编辑引发的转录组范围的脱靶RNA编辑”)。该论文提出的研究结果表明，科学家需要更全面地定义和表征基础编辑器平台的RNA脱靶效应。此外，该论文还证明可以修饰基础编辑器以减少脱靶转录组活性，同时保留目标基因组活性。

“我们显示，用大鼠APOBEC1的胞嘧啶碱基编辑器(CBE)可在人体细胞中引起广泛的转录组范围的RNA胞嘧啶脱氨基因，诱导成千上万的C-尿嘧啶(U)编辑，频率范围为0.07-100%。 38-58%的表达基因，“该文章的作者写道。“CBE诱导的RNA编辑发生在蛋白质编码序列和非蛋白质编码序列中，并产生错义，无义，剪接位点，5'UTR和3'UTR突变。”

在CRISPR引导的碱基编辑系统中，修饰的Cas9核酸酶与融合蛋白一起使用以到达靶向的基因组位点。此外，这些系统包含碱基改变酶 - 例如大鼠APOBEC1，脱氨酶 - 以修饰特定核苷酸，从而实现可导致特定DNA改变的变化。例如，大鼠APOBEC1用于将胞嘧啶改变为胸腺嘧啶的碱基编辑系统。

使用CBE与大鼠APOBEC1，MGH团队调查是否可能诱导脱靶RNA效应。他们在肝脏和胚胎肾细胞系中的实验表明，虽然他们测试的常用基因编辑器在靶DNA位点诱导了有效编辑，但它也导致整个转录组中数万个胞嘧啶 - 尿嘧啶编辑，完整细胞中转录的RNA范围。当他们测试一种较新的腺嘌呤靶向基础编辑时，他们发现了类似的结果。

为了研究减少或消除不需要的RNA编辑的可​​能性，MGH团队筛选了16名具有脱氨酶的工程化版本的编辑，确定了两种与原始版本同样有效的诱导靶向DNA效应，同时诱导显着较少的RNA编辑。实际上，这些SECURE(不需要的RNA编辑的选择性抑制)变体甚至比未改变的脱氨酶更精确地诱导所需的DNA编辑。

“我们设计了两种带有大鼠APOBEC1突变的CBE变异体，可大大减少人体细胞中RNA编辑的数量(减少> 390倍和> 3800倍)，”该研究的作者详述。“这些变体还显示出更精确的靶向DNA编辑，并且在测试的大多数gRNA中，编辑效率与野生型CBE观察到的相当。”

Joung指出，调查这些RNA效应对CRISPR碱基编辑的实验和临床应用的任何潜在影响是他的团队正在采取的重要下一步。

“对于研究应用，使用基础编辑的科学家需要在实验中考虑潜在的RNA脱靶效应，”他坚持说。“对于治疗应用，我们的研究结果进一步论证了将碱基编辑表达的持续时间限制在尽可能短的时间内，以及最小化和计算这些影响在安全评估中的潜在影响的重要性。”

“正在进行的工作的另一个重要领域是扩大我们的努力，以尽量减少这些不需要的脱靶RNA编辑，”Joung补充道。“我们目前正在尝试设计SECURE腺嘌呤碱基编辑器并探索使用其他脱氨酶的胞嘧啶碱基编辑器的脱靶RNA效应，而不是我们研究的编辑器中的脱氨酶。我们的目标是生成一套基础编辑器，最小化RNA编辑活动，可用于研究和治疗应用。“