一次分析基因组数百种变异

遗传学家一直在使用模式生物，从家养小鼠到单细胞面包酵母，酿酒酵母，研究调节人类发育和生理学的基本生物过程，并且可以在各种疾病中受到损害。这是可能的，因为在人类中控制这些过程的许多基因在其他物种中也具有相似的功能;并且因为模型生物中的基因可以在实验室中随意突变和删除。然而，到目前为止，即使在易于操作的酵母中，基因也必须一次删除一个基因，通常在其基因组中留下额外的不希望的序列修饰。

哈佛大学Wyss学院的一个团队由其核心学院成员George Church领导，现在提出了一种基于CRISPR-Cas9的自然生物技术战略，解决了这两个问题。使用面包酵母，研究人员开发了一种高通量方法，允许研究人员在单个酵母细胞中同时精确地改变单个基因的数百种不同基因或特征，效率为80%至100%，从显示特定行为的群体中选择细胞，并确定触发或阻止它们的基因改变。

“我们的方法不仅提供了一种更有效和更精确的方法来在酵母中进行高通量”功能基因组学“，而不是以前的方法。它还允许我们模拟和测试酵母细胞中微妙的人类基因变异。与某些特征或紊乱松散相关，并找出哪些可能与实际相关，“教授，博士，哈佛医学院(HMS)遗传学教授和哈佛大学健康科学与技术教授麻省理工学院(MIT)。

人类基因的变异通常不会从基因组中完整地删除它们的序列，而是由小点突变 - DNA代码中单个A，T，C或G碱基单元的替换组成 - 用于其他一个 - 或插入或删除一些基本单位。为了在没有其他潜在干扰变异的情况下在酵母基因组中重建这种变异，该团队利用CRISPR-Cas9，其可以在小指导RNA(sgRNA)的帮助下精确地靶向DNA中的预选序列。在Cas9酶切割其靶序列后，称为同源定向重组(HDR)的过程可以通过使用来自另外提供的携带感兴趣变异的供体模板序列的信息来修复基因。

“我们已经开发出一种策略，将sgRNA和供体模板的蓝图在一个稳定且可遗传的染色体外DNA分子(指导+供体)中进行物理连接。这使我们能够在一个反应​​中构建大型变体文库，提供多个相应的sgRNA和供体模板集成到酵母细胞，并通过下一代测序识别那些刺激某种细胞行为的模板，“该研究的第一作者之一，博士后研究员肖国国博士说。

在概念验证研究中，该团队首先关注编码DNA解旋酶和修复酶SGS1的单个高度保守基因。然后，他们用毒性试剂广泛破坏携带指导+供体文库的酵母细胞群的DNA，并对存活细胞的DNA进行测序。这使他们能够发现损害SGS1特征的突变，这些特征对于修复受损DNA至关重要，并保证细胞的持续存活。

接下来，该团队应用他们的指导+捐赠者策略删除了一个知之甚少的基因家族的315个成员，这些基因家族编码所谓的小型开放阅读框(smORF)，这些框架分散在整个基因组中，一举一动。通过分析这会如何影响酵母细胞在不同环境胁迫条件下的存活率，他们可以将以前未知的基本功能分配给特定的smORF，从而为他们的分析打开一个新的门户。

“除了使用该方法从基因和更大的基因家族中挑出新功能外，一个有趣的潜力还在于研究基因组中的非编码序列，以促进我们对基因调控和染色体生物学的理解，”首先说通讯作者Alejandro Chavez博士，博士后，由Church和Wyss Institute核心学院成员James Collins共同指导，现任哥伦比亚大学助理教授。

与该团队合作的柯林斯博士也是麻省理工学院医学工程与科学的Termeer教授和麻省理工学院的生物工程教授。“我们还可以将指导+供体方法用于合成生物学应用，旨在设计具有特定代谢和工业相关能力的酵母细胞，或将其转移到病理酵母菌株中，以发现影响其感染性质的基因和基因功能，”他说。

“通过教会和柯林斯实验室之间的动态合作而出现的CRISPR-Cas9技术的这一最新应用开启了另一条途径，即发现先前隐藏的分子机制，通过这些分子机制细胞调节其生理机能，并且当失调时，导致感染以及人类疾病，“Wyss研究所创始主任Donald Ingber，医学博士，博士，同时也是HMS血管生物学的犹大民俗教授和波士顿儿童医院血管生物学项目，以及哈佛大学生物工程教授John A. Paulson工程与应用科学学院。