新的DNA合成技术有望实现快速高保真的DNA印刷

加州大学伯克利分校和劳伦斯伯克利国家实验室的科学家发明了一种合成DNA的新方法，该方法有望更容易，更快，不需要使用有毒化学品，而且可能更准确。

该技术具有更高的准确性，可以产生比现今方法长10倍的DNA链。研究人员表示，易用性可能导致研究实验室中无处不在的“DNA打印机”，类似于当今许多研讨会中的3D打印机。

加州大学伯克利分校的研究生Dan Arlow说：“如果你是一名机械工程师，那么在你的商店里安装一台可以在一夜之间打印出一部分的3D打印机真的很不错，所以你可以在第二天早上进行测试。”“如果你是一名研究人员或生物工程师，并且你有一种简化DNA合成的工具，'DNA打印机'，你可以更快地测试你的想法并尝试更多新想法。我认为这会带来很多创新。”

Arlow和同事Sebastian Palluk是德国达姆施塔特工业大学的博士生，也是伯克利实验室的一名访问学生，他们在6月18日在线出版并计划在7月出版的Nature Biotechnology杂志上发表他们的新方法。他们和他们的同事在加利福尼亚州埃默里维尔的能源部联合生物能源研究所进行了这项研究。

“我个人认为丹和塞巴斯蒂安的新方法可以彻底改变我们制造DNA的方式，”加州大学伯克利分校化学和生物分子工程教授，伯克利实验室高级教员科学家和JBEI首席执行官杰伊凯斯林说。

Palluk来自德国专门与Arlow一起研究Keasling实验室的DNA合成问题，该实验室一直是合成生物学领域的先驱。Keasling和JBEI科学家专门为微生物(主要是酵母和细菌)添加基因，以可持续的方式生产有用的产品 - 药物，燃料，工业化学品，副产物毒性最低，能耗最低。

“我们相信，增加DNA结构的使用将加速疾病新疗法的开发，并简化新药的生产，”Palluk说。

40年的合成过程

合成DNA是一项不断发展的业务，因为公司订购定制基因，因此他们可以在微生物大桶中生产生物药物，工业酶或有用的化学物质。研究人员购买合成基因以插入植物或动物或尝试新的基于CRISPR的疾病疗法。

一些科学家甚至提出将信息存储在DNA中，就像今天存储在计算机硬盘中的数字数据一样，因为一克DNA理论上可以存储相当于5000万张DVD并且应该稳定几个世纪。然而，这意味着合成比目前生物技术行业中使用的DNA链更多的DNA链。

所有这些应用都要求合成过程忠实地产生所需的核苷酸或碱基序列 - DNA的构建块 - 在数百万甚至数十亿拷贝的DNA分子中。

目前的DNA合成，其历史可以追溯到1981年，并且使用来自有机化学实验室的技术，仅限于直接生产约200个碱基长的所谓寡核苷酸，因为随着长度的增加，该过程中的不可避免的错误导致正确序列的低产率。为了组装一个小基因，科学家们必须在约200个碱基长的片段中逐步合成它，然后将它们缝合在一起。这是耗时的，通常需要多次尝试，有时甚至完全失败。

此外，当从Twist Biosciences Inc.和Integrated DNA Technologies(IDT)等合成公司订购时，一个约1,500个碱基长的小基因的周转时间可能是两周，成本为300美元，限制了研究人员可以进行的基因调整数量。能够尝试和他们可以尝试的速度。像Keasling，Arlow和Palluk这样的合成生物学家经常将十几种不同的基因一次性插入微生物中，使其产生所需的化学物质，每种基因都有其自身的合成问题。

“作为德国的一名学生，我参加了国际合成生物学竞赛iGEM，在那里我们试图让大肠杆菌细菌降解塑料废物。但我很快意识到，大部分研究时间都用于获取所有的DNA一起，没有做实验，看看工程细胞是否可以分解塑料。这真的促使我研究DNA合成过程，“Palluk说。

化学DNA合成还需要使用具有毒性的特定类型的活化DNA构建块，以及用石油衍生的溶剂洗涤的重复循环。Arlow说，废物处理的问题以及由于对水分极其敏感而使该过程变得挑剔的事实是研究人员摆脱他们的个人寡核苷酸合成器并且现在由专业公司合成DNA的原因。

攻击免疫系统

这项新技术依赖于在免疫系统细胞中发现的DNA合成酶，该酶天然具有向水中现有DNA分子添加核苷酸的能力，其中DNA最稳定。该技术有望提高精确度，这可以使DNA链的合成时间延长10倍，或数千碱基长 - 中等大小基因的大小。

“我们已经想出了一种合成DNA的新方法，它利用了大自然用来制造DNA的机器，”Palluk说。“这种方法很有前途，因为酶已经进化了数百万年才能完成这种精确的化学反应。”

细胞通常不会从头开始合成DNA;它们大多是在许多不同的聚合酶的帮助下复制的，这些聚合酶基于细胞中已有的DNA模板。然而，在20世纪60年代，科学家们发现了一种不寻常的聚合酶，它不依赖于现有的DNA模板，而是随机地将核苷酸添加到制造免疫系统抗体的基因中。这种酶被称为末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，在这些基因中产生随机变异，因此得到的抗体蛋白能够更好地靶向前所未见的入侵者。

Paldk说，TdT同样可以很好地添加所有四种DNA核苷酸，没有副反应可能会破坏所产生的分子，并且非常快，如果你让它自由轮，每分钟扩展DNA大约200个碱基。

多年来，许多实验室试图利用这种酶合成所需的DNA序列，但酶很难控制。关键要求是弄清楚如何使酶添加一个核苷酸然后停止，以便可以一次一个碱基合成所需的序列。所有先前的提议都试图通过使用具有阻止多次添加的特殊阻断基团的修饰核苷酸来实现该控制。在DNA分子被封闭的核苷酸延伸后，除去封闭基团以进行下一次添加。

“这些方法与下一代测序技术有很多共同之处，”Palluk说，指的是用于读取遗传序列的最先进技术，它通过使用模板依赖性聚合酶顺序添加阻断以不同颜色发荧光的核苷酸，表明添加了四种可能碱基中的哪一种。

虽然用于测序的DNA复制酶能够在添加的核苷酸上容纳阻断基团，但TdT不能。当核苷酸正确定位用于反应时，其反应位点太紧以不适合阻断基团。

Arlow的想法是将未阻断的核苷酸牢固地连接到TdT，以便在将核苷酸添加到生长中的DNA分子后，酶保持附着并且自身保护链的末端免于进一步添加。在DNA分子延伸后，它们切断连接系链以释放酶并重新暴露末端以进行下一次添加。

在他们的第一次试验中 - 使用工程化TdT酶创建10碱基寡核苷酸的10个循环 - 伯克利研究人员表明，他们的快速和简单技术在合成的每个步骤中几乎与当前技术一样准确。

“当我们使用NGS分析产品时，我们能够确定大约80%的分子具有所需的10碱基序列，”Arlow说。“这意味着，平均而言，每一步的收益率都在98%左右，这对于这个50多岁的问题首次出现并不算太糟糕。我们希望达到99.9%以便制造基因 - 长DNA。“

Palluk说，一旦它们达到99.9%的保真度，它们可以一次合成一个1000碱基长的分子，产率超过35%，这在目前的化学合成技术中是完全不可能的。

“通过直接合成较长的DNA分子，将寡核苷酸缝合在一起的需要以及这一繁琐过程产生的局限性可以减少。我们的梦想是直接合成基因长度序列，并在几天内将它们送到研究人员，”他说。

“我们的希望是，该技术将使生物工程师更容易更快地找到如何生产有用产品的生物制造，这可能导致生产我们在世界上依赖的东西的更可持续的过程，包括服装，燃料和食品，以一种需要较少石油的方式，“阿洛说。