最小的生命形式具有最小的工作CRISPR系统

包含地球上一些最小生命形式的古老微生物群也拥有迄今为止发现的最小的CRISPR基因编辑机制。被称为Cas14 的peewee 蛋白质机制仅与Cas9蛋白质的三分之一相关，Cas9蛋白质是革命性基因编辑工具CRISPR-Cas9的商业终端。虽然Cas9是从细菌中分离出来的，但Cas14是在一群古细菌 - 一种细菌的原始亲属 - 的基因组中发现的，它包含一些已知的最小细胞和最小的基因组。

Cas9和其他Cas蛋白是微生物进化的防御系统的一部分，以保护自己免受病毒侵害。所有这些都是靶向酶，它们非常有选择性地寻找和结合微生物中的特定DNA或RNA序列，这些酶与早期病毒感染后存储在其CRISPR记忆库中的序列相匹配 - 然后切割DNA或RNA以禁用新的入侵者。

与Cas9一样，Cas14具有生物技术工具的潜力。由于其体积小，Cas14可用于编辑小细胞或某些病毒中的基因。但凭借其单链DNA切割活性，它更有可能改善目前正在开发的传染病，基因突变和癌症的快速CRISPR诊断系统。

“对于分子诊断学，你希望能够靶向双链DNA，单链DNA和RNA，”加州大学伯克利分校研究生Lucas Harrington说道，他是报道这一发现的论文的第一作者。“Cas12非常擅长双链DNA识别，Cas13非常擅长单链RNA识别，现在Cas14完成了这一系列：它非常擅长单链DNA识别。”

Cas14类似于Cas12和Cas13，因为在与其靶DNA序列结合后，它开始不加选择地切割细胞内的所有单链DNA。相反，Cas9仅结合并切割靶DNA。

肆意切割DNA是治疗中可能的缺点，但在诊断方面具有很大的优势。Cas14蛋白可以与附着在一条单链DNA上的荧光标记物配对。当Cas14与其靶DNA序列(一种癌基因或感染性细菌中的基因)结合并开始切割DNA时，它也会切割与标记物连接的DNA，从而产生荧光信号。

“Cas14以比Cas12更具体的方式靶向单链DNA，”Harrington的同事Janice Chen补充道，她最近获得了博士学位。来自加州大学伯克利分校。“这是一个非常意外的发现。因为它太小了，我们几乎认为它不起作用，但实际上它是超级特定的，这使它成为诊断工具箱的一个非常强大的补充。”

Harrington，Chen及其同事，包括CRISPR-Cas9发明人Jennifer Doudna，加州大学伯克利分校，细胞生物学和化学教授，已经改编Cas14，使用名为DETECTR的诊断系统，现在使用Cas12和Cas13快速检测传染性生物和基因突变的存在。Harrington，Doudna和Chen是一家名为Mammoth Biosciences的公司的联合创始人，该公司正在将DETECTR商业化。

该发现将于10月18日在“ 科学 ”杂志上的印刷出版之前在线报道。Doudna是霍华德休斯医学研究所的研究员和创新基因组学研究所的联合主任。Banfield是IGI的微生物学领导者。

采矿宏基因组

Cas14蛋白是由联合第一作者Harrington和现任以色列特拉维夫大学教授David Burstein发现的，因为他们在过去15年由加州大学伯克利分校同事创建的微生物基因组数据库中寻找Cas变体。由地球与行星科学和环境科学，政策与管理教授Jill Banfield领导的团队。通过对来自各种外来环境的样品中的所有DNA进行宏基因组测序，获得数万个基因组。在从科罗拉多州Rifle的有毒净化场所获得的地下水样品中测序的古细菌基因组中发现了Cas14。

两年前，Harrington和Burstein在挖掘宏基因组学数据库时发现了其他小Cas蛋白，CasX和CasY。

Cas14的长度为CasX的400-700个氨基酸的一半，小于所有其他已知的Cas系统，其长度范围为950-1,400个氨基酸。

“偶然，我们发现这些非常小的蛋白质，其他人只是扔掉了，因为它们看起来不像以前已知的CRISPR系统。它们太小了，”哈灵顿说。“我们决定，哎呀，让我们试一试。我们测试了它，我们真的很震惊地发现这些是真正的功能系统。”

在数据库中找到Cas14的基因只是一个开始。迄今为止，大多数Cas蛋白已在细菌中发现，因此在标准实验室细菌大肠杆菌中发挥良好作用。但是Cas14来自古细菌 - 一群最小的古细菌，叫做DPANN。所有Cas蛋白都含有一些RNA用于靶向和结合，但Cas14不能与CRISPR-Cas9 RNA一起使用，因此该团队还必须从数据库中捕获Cas14必须存在的两个RNA才能发挥作用。

此外，DPANN Archaea不能在实验室中种植 - 它们似乎是寄生的或在某种程度上依赖于其他较大的古菌 - 因此研究人员必须在试管中创造合适的环境。

Harrington说，与其在更原始的微生物中的起源一致，细长的Cas14似乎是更大和更复杂的Cas9和Cas12蛋白的更原始的版本，暗示这些分子已经进化到更长时间以更加专业化。研究人员希望从这种原始的Cas蛋白中学习，Cas蛋白是Cas酶的必需成分，因此他们可以设计出最紧凑，最时尚的基因切割器。

哈灵顿指出，宏基因组采矿发现了Cas14的各种版本，可能被证明是有用的生物技术工具。“一个令人惊奇的事情......就是这些系统的多样性，”他说。“我们已经描述了40多种新的CRISPR-Cas14系统和8种不同的亚型。这为研究这些新的CRISPR系统开辟了闸门。”