流动分级AF4和光散射探测亚微米蛋白质聚集

光散射仪器广泛用于表征溶液中的​​大颗粒和纳米颗粒。它提供了使用多角度光散射(MALS)，差示粘度测量，场流分级(FFF)，动态光散射(DLS)，电泳迁移率和确定绝对摩尔质量，大小，构象，电荷和相互作用的尖端工具。成分渐变。

Wyatt在仪器和软件方面的最新发展使FFF的全部潜力可以为更广泛的用户群所用。在这次采访中，Kim R. Williams和Christoph Johann就新技术及其研究与新闻 - 医学和生命科学进行了交流。

FFF最突出的特点是什么?我们为什么要使用FFF?

CJ：首先，我们应该回顾一下FFF最突出的特点。FFF根据尺寸物理分离样品，因此它允许我们收集馏分。使用Eclipse FFF系统，我们可以将实体从仅几纳米到几微米的尺寸分开。此外，该技术温和，施加低剪切力，并且是非破坏性的。

当与MALS结合使用时，FFF特别有效，MALS提供洗脱级分的绝对摩尔质量和大小。因为它结合了基于尺寸的分离和在线光散射，所以它具有比标准批量或未分级DLS更高的分辨率。

此外，我认为支持离线方法开发的新SCOUT DPS软件是一个令人兴奋的附加功能。该软件最大限度地减少了方法开发所需的实验数量。只需少量注射即可获得最佳结果，而不是在实验室中花费数小时。

从FFF实验中获得什么类型的数据?

CJ：我们可以从每个洗脱体积的多角度光散射分析中获得绝对摩尔质量和RMS半径的详细分布。此外，我们可以通过动态光散射计算每个洗脱体积的流体动力学半径，或者从FFF保留时间得出它。

对于大分子，浓度来自UV或折射率检测器以获得定量分布，而对于纳米颗粒，颗粒浓度的分布仅通过光散射来量化。

您如何确保蛋白质不与AF4膜相互作用?

KRW：重要的是验证蛋白质与AF4中使用的膜之间没有相互作用，特别是当AF4用于从保留时间计算粒径时。

我认为在没有交叉流动的情况下进行初始运行总是明智的，以确保注入足够的样品并且在检测器中获得非常大的峰值。如果您发现自己处于完全样品丢失的严重情况，您可以通过降低场强或交叉流速来纠正它。

通过预处理膜，例如通过注入蛋白质溶液，或通过减少盐负荷，也可以减少相互作用。我发现50毫摩尔氯化钠溶液，甚至没有加入盐的磷酸盐缓冲液都可以提高FFF的分辨率和回收率。您不必总是使用含有150毫摩尔氯化钠的PBS缓冲液，这在体积排阻色谱MALS中很常见。

你能描述Eclipse FFF吗?

CJ：我认为最重要的是Eclipse FFF易于使用，同时又是一个强大而强大的系统。它结合了三个关键特性：无缝集成; 完整系统的完全自动化和广泛的数据处理能力。

能够使用新的VISION CSH软件平台将完整的工作流程从方法开发集成到最终结果非常棒。这包括用于仪器控制和运行实验的VOYAGER CDS应用程序以及用于数据处理和方法开发的SCOUT DPS应用程序。

我希望我们在仪器和软件方面的新发展将使更多用户能够获得FFF的全部潜力。

如何使用SCOUT进行方法开发?

CJ：SCOUT帮助我们选择正确的流程来实现理想的分离。我们只需要将我们想要的通道几何形状和假定的样品粒度范围输入到SCOUT中，建立一个标称流程序，并且通过它可以直接给出一个预测的分形图。

流程程序包括通道流速和横流速率随时间的演变。预计的峰值立即显示其计算的保留时间，并且它还给出了峰值稀释度。我们可以更改参数，例如通道长度或流速，以查看效果。这一切都很快就由软件决定，为我们节省了大量的实验时间。

根据我们的经验，SCOUT预测非常准确，并且紧跟实际实验的UV痕迹。

通过这种方式，我们可以直接找到一种能够提供合适分辨率的方法。一旦我们选择了合适的方法，我们就可以将它导出到VOYAGER，它将运行实验。

FFF如何帮助了解抗体的聚集动力学?分析生物药物有哪些挑战?

KRW：常规药物通常是配制成胶囊的小分子，具有较长的保质期。相比之下，生物治疗药物或生物药物是形态上异质的大型复杂分子。

它们在溶液中配制并通过注射器注射或静脉内输注施用。与他们的分析相关的主要挑战源于他们往往不稳定且对压力敏感的事实。

因此，对我们来说，使用不会使生物药物降解或变性的分析过程非常重要。有多个加工步骤和应激源可导致不可逆的变性，例如温度，pH和溶液组成。

如果抗体单体变性，则发生聚集和沉淀，这将在注射入患者时降低其功效并增加其免疫原性的可能性。区分这些蛋白质聚集体和可能的外来污染物也很重要，例如硅油微滴，气泡，甚至玻璃碎片或橡胶碎片。

哪种技术可用于表征蛋白质聚集体?

KRW：使用的技术实际上取决于蛋白质的大小。对于超过一微米的蛋白质，存在几种技术，但是用于分析纳米至一微米范围内的蛋白质的技术非常少。

尺寸排阻色谱(SEC)是目前最常用于观察蛋白质聚集体的方法，但它并不理想。首先，流动相组成是有限的，这最大限度地减少了柱填料表面上的吸收。其次，可用的孔径限制了每个柱可以分离的尺寸范围。

第三，填充柱将导致剪切降解，这在研究瞬态聚集体时尤其成问题。最后，为避免色谱柱堵塞，通常会对样品进行过滤或超离心分离，并且不知道在此过程中是否清除了哪些样品。

我们开发了一种基于非对称流动FFF(AF4)和光散射的简单方法，以满足对SEC中丢失物质的信息的需求：较大的聚集体或在柱上经受剪切的聚集体。它使我们能够获得亚微米蛋白质聚集体的信息。

您能告诉我们更多关于这种方法的优点吗?

KRW：不对称流动FFF涉及在没有填料的情况下在开放通道中分离组分。垂直于分离轴施加场以形成交叉流动。使用开放通道可以在很宽的尺寸范围内进行分离，范围从1纳米到数十微米。然而，我们发现它对于10 4至大于10 8道尔顿范围内的大分子表现最佳。

关于载液的选择存在很大的灵活性，因为与分离表面的相互作用较少。

此外，我们发现通过调整交叉流速可以轻松调整分离，这反过来会改变场强，然后改变保留时间。

当分析100纳米及以上的较大分析物(包括抗体聚集体)时，AF4优于尺寸排阻色谱法。

那么它如何与光散射技术相结合呢?

KRW：AF4中的保留时间可以与平移扩散系数相关，而平移扩散系数又可以使用斯托克斯 - 爱因斯坦方程与流体动力学半径相关。从本质上讲，AF4基于流体动力学尺寸实现了分离。

一旦样品通过AF4进行了尺寸分离，它们就会暴露在在线光散射检测器中。如果使用多角度光散射(MALS)检测器，则可以获得摩尔质量和均方根半径的测量值。如果使用动态光散射(DLS)检测器，则可以测量平移扩散系数，由此可以使用斯托克斯爱因斯坦方程计算流体动力学半径。

AF4和光散射是具有重要协同能力的互补技术。AF4能够取出多相多分散样品并将其分离成单分散的部分。然后，MALS和DLS提供摩尔质量和尺寸的正交测量。可以将这些值与使用AF4理论计算的AF4值进行比较。

AF4 MALS如何用于研究蛋白质聚集动力学?

KRW：形成蛋白质聚集体有四个基本阶段。阶段1是与另一种反应性单体的部分展开和可逆缔合; 第2阶段是不可逆的聚集核形成; 阶段3是链聚合; 第4阶段是聚合凝结。最终结果是形成可溶性高摩尔质量的亚微米物质，这正是我们试图表征的

Lumry-Eyring有核聚合(LENP)聚集模型提供了比以前的模型更全面的非天然聚集动力学的定量描述，因为它包含所有这些不同的阶段。LENP模型评估三种不同的时间尺度：成核时间(t n); 改变聚合的时间(t g); 和凝结时间(t c)。

使用一系列微分方程，如果单体分数和聚集体的摩尔质量可以确定为时间的函数，则可以确定t n，t g和t c。这可以通过AF4和MALS实现。

当我们将该技术应用于抗链霉抗生物素蛋白IgG1样品时，我们看到了两个峰。第一个峰出现在7.5分钟，这是150千道尔顿单体(相当于抗链霉抗生物素蛋白IgG1的摩尔质量)。我们在大约9分钟后看到的第二个峰值是聚合物。因此，我们设法分离单体和聚集体。

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监测这些峰的大小使我们能够研究应激(例如热)对被监测蛋白质的影响。没有加热，150千道尔顿单体只有一个峰。当施加热量时，我们看到聚集峰出现并且随着时间的推移其尺寸增加，因为更多的蛋白质通过暴露于热量而变性。然后将单体峰的大小作为应力时间的函数作图。来自AF4-MALS的数据点显示随着应力时间增加单体损失增加。然后，从拟合线，我们可以确定t n，t c和t g的值。

通过这种方式，使用AF4和MALS分析，我们已经证明离心样品是尺寸排阻色谱之前的常见做法，它改变了每个步骤的时间尺度：成核步骤，链聚合步骤和聚集缩合步骤。在抗链霉抗生物素蛋白IgG1的情况下，该变化不足以改变聚集的动力学。

AF4分离对蛋白质聚集体有何影响?

KRW：我们在热应激后和加入柠檬酸后使用FFF评估了蛋白质聚集体的稳定性。我们可以跟踪样本随时间的变化程度。

我们发现AF4聚焦步骤没有产生抗链霉抗生物素蛋白IgG1聚集体。然而，载体液体组合物确实影响聚集体稳定性，并且在稀释期间倾向于发生聚集体缔合。

AF4中的稀释主要发生在通道出口处，而不是在分离过程中。与尺寸排阻色谱法相比，这可以为分离浓度敏感的分析物提供更宽容的条件。

AF4和尺寸排阻色谱MALS如何比较蛋白质聚集研究?

KRW尺寸排阻色谱和AF4是基于互补尺寸的分离技术。尺寸排阻色谱法对于小型低聚物具有更好的分辨率，而AF4更适合分析高级摩尔质量聚集体，尤其是那些易于产生剪切应力的聚集体。

定性动力学研究表明，AF4甚至可以达到20微米的聚集体，这是尺寸排阻色谱法无法实现的尺寸范围。

我们相信AF4 MALS可以提供​​动力学机制的重要见解，并能够研究聚集体的稳定性。