用不平衡的Cas9 gRNA比率优化CRISPR基因校正

通过正确的改进，CRISPR基因编辑系统可以彻底改变基因治疗。例如，CRISPR需要引入更少的脱靶效应，更不用说有害的目标效应。但即使CRISPR达到目标并发挥预期效果，仍存在另一个问题：效率。幸运的是，德州大学西南医学中心的科学家们报告说，CRISPR的效率可能很容易提高。只需调整关键CRISPR成分 - Cas9蛋白和指导RNA(gRNA)的剂量即可。

美国西南部大学的科学家在为Duchenne肌营养不良症(DMD)进行基因治疗时，采用了简单的提高效率的策略。通过反复试验，科学家们发现，使用10比1的gRNA与Cas9比例可以对关键DMD基因缺陷进行最佳编辑，即外显子44缺失突变。科学家们认为，与1：1的比例相比，10比1的效率提高了约10倍。

科学家工作的详细研究结果发表在3月6日的科学进展杂志上，题为“ CRISPR-Cas9纠正小鼠和人类细胞中Duchenne肌营养不良症外显子44缺失突变 ”的文章。文章描述了科学家如何纠正外显子44在患者衍生的诱导多能干细胞中以及在具有相同缺失的新小鼠模型中缺失。虽然目前的研究主要集中在DMD，但该研究的结果可能对优化DMD以外疾病的基因治疗产生影响。

“使用AAV9编码Cas9和单一指导RNA，我们还证明了这些基因编辑组分的剂量对于体内最佳基因校正的重要性，”该文章的作者写道。“我们还表明，单个指导RNA出乎意料地限制了体内最佳基因编辑，并且通过优化编码Cas9和单一指导RNA的AAV的剂量，编辑效率可提高~10倍。”

由埃里克奥尔森博士，教授和分子生物学主席领导的UT西南科学家开发了一种方法，通过将Cas9加载到腺病毒相关病毒(AAV)中来编辑肌营养不良蛋白基因的缺陷部分，这是一种无害的病毒。将编辑组件传递到单元格中。还将指导RNA加载到AAV中以将Cas9引导至其突破DNA的突变。

编辑过程绕过突变并使肌纤维产生肌营养不良蛋白，Olson在大型哺乳动物，小鼠和人类细胞的先前研究中记录了阳性结果。

在这些研究中，研究小组使用标准的1比1的Cas9和指导RNA来帮助肌肉中的肌营养不良蛋白恢复至正常值的90%以上。

在针对该基因不同部分的新研究中，他们发现1比1的比例不起作用：肌营养不良蛋白的产生仅在输送到血液中时恢复到正常值的5%。

科学家们发现，使用10比1的指导RNA与Cas9的比例可以对肌营养不良蛋白基因的特定片段进行最佳编辑。在CRISPR剂量的四周内，在具有共同DMD突变的小鼠中约90%的肌肉和心脏纤维中恢复肌营养不良蛋白的产生。

“这是令人惊讶的，”该研究的第一作者Yi-Li Min说。“我们总是使用等量的两种病毒来提供指导RNA和Cas9，并没有考虑改变比例。”

DMD是男孩中最常见的致命遗传疾病，导致肌肉和心脏衰竭，并在30年代早期导致过早死亡。随着肌肉退化，患者被迫坐轮椅，最终因为膈肌减弱而进入呼吸器。尽管科学家们已经知道，构成长肌营养不良蛋白基因的79个外显子中的任何一个缺陷都会导致这种情况，但是没有有效的治疗方法存在。

Olson发表了多项研究，他的实验室在DNA的战略要点进行单一切割以纠正突变。包括他最新研究的重点是删除外显子44，他的实验室已经创建了针对DMD患者中五种最常见缺陷的CRISPR技术，占全球约一半的病例。外显子44的临床治疗，其位于该基因上最常见的突变热点之一，可使约12%的患者受益。

这些技术尚未被批准用于临床，但是Olson的团队在发表一项科学研究显示外显子51的CRISPR编辑阻止了狗的DMD进展后，去年朝着这个目标迈出了重要的一步。

在基因编辑的几周内，缺失的蛋白质在整个身体的肌肉组织中恢复，包括心脏中92%的校正和膈肌的58%，这是呼吸所需的主要肌肉。科学家估计需要15%的阈值才能显着帮助患者。

该实验室正在对狗进行长期研究，以测量肌营养不良蛋白水平是否保持稳定，并确保基因编辑没有不良副作用。

Olson希望下一步超越狗只是一项临床试验，这将是UT西南大学的基因治疗计划旨在在未来几年推出以解决许多致命的儿童疾病。

“在我们临床使用之前，我们还有更多工作要做，”奥尔森说，“但看到我们走了多远，我们感到非常兴奋。”

“当我们在肌营养不良蛋白基因的其他缺陷部位检测CRISPR时，调整我们的公式以获得最佳结果可能很重要，”Olson补充说。“这种新的见解进一步促进了CRISPR作为Duchenne疗法的应用，也许还有许多其他疾病。”