研究人员揭示了由胞嘧啶碱基编辑引起的意外全基因组脱靶突变

中国科学家发现胞嘧啶碱基编辑器(BE3和HF1-BE3)诱导全基因组脱靶突变。由中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞教授领导的研究小组利用水稻全基因组测序(WGS)对BE3，HF1-BE3和ABE 的脱靶突变进行了全面调查。，一种重要的作物品种。

单核苷酸改变是人类疾病和经济生物中性状变异的重要原因。核碱基编码器对单核苷酸多态性的基因工程为基因治疗带来了巨大希望，它可以潜在地治愈人类疾病并改善作物植物的性状。

研究人员已经开发出胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器(分别是CBE和ABE)。基础编辑器是切口酶型Cas9蛋白与胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶的融合，并且已经发现催化单个指导RNA(sgRNA)的靶位点中C> T或A> G的转化。 。

尽管CBE和ABE的靶向转化在许多生物体中发现，但它们的脱靶效应尚未在全基因组水平上进行系统评估。

基础编辑特异性的过去分析主要局限于使用计算机软件预测的类似靶标的位点。这些类似靶标的位点通常数量少并且基因组分布受限。

考虑到大肠杆菌，酵母细胞和人类细胞中胞嘧啶脱氨酶的异位表达已经被发现引发全基因组脱氨基因事件，在全基因组水平和检测基因编辑器的特异性已经变得必要和迫切。无偏见的方式。

研究人员选择了三种广泛使用的基础编辑器：BE3，高保真BE3(HF1-BE3)和ABE。将靶向11个基因组位点的总共14个碱基编辑构建体通过农杆菌转化转化到水稻中。

由BE3，HF1-BE3或ABE编辑的再生T0植物和用基础编辑但没有sgRNA转化的植物，以及两个对照组的植物(即野生型水稻和转基因水稻的无效分离株)，由WGS分析。

基础编辑器组和控制组在找到的插入数量上没有显着差异。相反，BE3和HF1-BE3组具有比ABE和对照组显着更多的单核苷酸变体(SNV)。

每株植物的C> T单核苷酸变体(SNV)的平均数为：203(BE3); 347(HF1-BE3); 88(ABE); 和105(对照组)。因此，BE3和HF1-BE3植物中的C> T SNV分别比对照植物高94.5%和231.9%。

值得注意的是，在没有sgRNA的情况下用BE3和HF1-BE3处理水稻植物也导致大量的C> T SNV。此外，由BE3和HF1-BE3赋予的绝大多数额外C> T突变与使用计算机软件(Cas-OFFinder)预测的脱靶位点不匹配。

发现所有SNV以及C> T SNV分布在整个水稻基因组中，表明全基因组发生。用转录组数据作图显示，与转录的基因区域相比，与BE3和HF1-BE3相关的大量C> T SNV更频繁地发生，其中由于活性转录而产生单链DNA。

总而言之，高博士团队生成的数据表明，BE3和HF1-BE3(而非ABE)在水稻中诱导全基因组脱靶突变。这些脱靶突变，主要是C> T SNV并且在转录的基因区域中富集，不是通过当前的计算机方法预测的。含有胞嘧啶脱氨酶的碱基转化单元可能是BE3和HF1-BE3引发的大量脱靶SNV的原因，需要进行优化以提高胞嘧啶碱基编辑的特异性。

“基因编辑器代表了一种吸引人的工具，用于产生植物育种所需的精确遗传变异。这些编辑的特异性至关重要，因为脱靶突变可能是有害的。我们发现当前的BE3或HF1-BE3导致意外和不可预测的基因组植物中广泛的脱靶突变，凸显了优化这类编辑特异性的紧迫性，“高博士说。