实验室提供新的策略 基因组编辑工具

莱斯大学的生物工程师已经发现了精确基因组编辑的新技术，这些技术更准确，并且具有更少的脱靶错误。在即将发表的关于改进革命性基因组编辑技术CRISPR-Cas9的特刊“自然期刊分子治疗 ”中，三篇论文分享了这些新策略。

生物工程学教授Gang Bao及其同事提出了使用能够切割DNA的生物催化剂(称为“工程化核酸酶”)最大化目标基因编辑的想法。多年来已经研究了几种这样的系统，但是在过去的三年中，通过CRISPR-Cas9进行剪切和粘贴编辑的前景引起了全世界科学家的关注。

CRISPR-Cas9是细菌中天然存在的防御系统，它允许研究人员设计一种称为“指导RNA”的短序列RNA，其靶向细胞中特定的遗传密码(DNA)部分。然后，相关的Cas9蛋白切割切片，破坏切片或用所需的代码替换它。

这就是细菌利用CRISPR-Cas9从疾病中免疫的方式。暴露于入侵者会通过将入侵者的遗传特征添加到CRISPR数据库来使细菌适应。然后细菌识别未来的敌人并用适当的Cas9蛋白质摧毁它们。

大约三年前，研究人员发现细菌CRISPR-Cas9可被修饰以编辑人类细胞中的DNA，例如，用正常或“野生型”序列替换突变序列，其方式与细菌入侵入侵者DNA的方式大致相同。签名。该技术被视为具有疾病建模和治疗，合成生物学和分子途径解剖的巨大潜力。

但是，CRISPR-Cas9仍然容易被剪掉错误的序列 - 称为“脱靶” - 除了正确的序列之外。在治疗应用中，Bao说，CRISPR-Cas9的脱靶切割可能会导致许多不利影响，包括癌症。

Bao于2015年获得了德克萨斯州癌症预防与研究所的资助，于2015年转到Rice的生物科学研究合作组织(BRC)，正在研究改进CRISPR-Cas9的方法，他称之为“用于编辑基因的纳米剪刀”。

他的目标之一是治疗遗传性疾病镰状细胞性贫血，他希望CRISPR-Cas9最终治愈。但首先，治疗必须变得更好，以避免可能导致不良副作用的脱靶。

在其中两篇论文中，研究人员研究了不同的直系同源物：Cas9蛋白来自与CRISPR / Cas9中常用的化脓性链球菌(Spy)细菌具有相同祖先的物种。

“我们在这些论文中的方法是探索使用不同Cas9直向同源物的可能性，”鲍说。“有很多种可能性。”

在第一篇论文中，Bao和他的小组利用哺乳动物细胞的实验来表征来自脑膜炎奈瑟氏球菌(Nme)细菌的CRISPR-Cas9系统。他说，它与Spy的不同之处在于生物工程师可以用来降低脱靶编辑的风险。

这种差异主要在于一系列代码不是目标的一部分，而是靠近目标。它被称为原型间隔区相邻基序(PAM)，它是靶DNA序列的标记，是Cas9蛋白结合所必需的。在Spy Cas9编辑中，PAM序列通常是三个核苷酸长。对于Nme，所需的PAM序列显着更长--8个核苷酸。研究人员表示，虽然Nme可能会找到更少的目标，但这些目标更可能是正确的目标。他们认为，这可能使其成为基因编辑的更安全的替代品。

第二篇论文是与德国弗莱堡大学的同事合作，利用另一种细菌的免疫系统解决了高度特异的人类基因编辑问题。对于这项研究，来自Spy的Cas9蛋白被嗜热链球菌(Sth)蛋白替代，这些蛋白也识别更长的PAM。在人类细胞中进行的测试发现，具有更严格的PAM要求的Sth 蛋白在避免脱靶时显着优于Spy Cas9蛋白。

Bao和公司还研究了可影响靶向的DNA和RNA中凸起的影响。当序列比引导RNA靶向的预期DNA序列长一个核苷酸或短一个核苷酸时，出现凸起。

“我们发现，即使DNA或RNA膨胀，Cas9蛋白仍可以切割，”他说。“这是一个独特的贡献。没有人看到会是这种情况，但我们证明了这一点。因此，我们开发了一个基于Web的工具来搜索三个潜在的脱靶位点，其中包含碱基错配，RNA凸起和DNA凸起“。

Bao指出，与Spy不同，Nme和Sth Cas9蛋白小到足以包装在腺相关病毒中，用于递送和治疗动物中的特定细胞。“这是另一个优势，也是我们为什么要继续探索这两个系统，”他说。

第三篇论文是对当前CRISPR-Cas9技术的综述，该技术侧重于可用于靶标选择，实验方法和验证的基因组编辑工具。鲍和他的团队还列出了一系列尚未解决的挑战，以消除脱靶效应。

他说有一条前进的道路，部分原因在于他对两种新细菌系统的研究，以及CRISPR-Cas9在实验室中比其他基因组编辑系统如TALEN和锌指更容易实施的事实。核酸酶。

Bao说，与那些较旧的基因组编辑技术不同，CRISPR-Cas9很容易让学生在短时间内学习和使用。

Bao希望将他的实验室建立为德克萨斯医疗中心基因组编辑的焦点。为此，他于去年12月将TMC基因组编辑社区聚集在一起参加BRC的一次参加人数众多的研讨会。

“我们进行了很多讨论，”他说。“我想激发的一件事是在TMC的许多实验室中使用CRISPR形成一个联盟。他们需要针对不同的应用设计CRISPR系统，但是有很多共同的问题。如果我们一起工作，它将会更容易解决它们。“

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