更简单的技术产生针对一系列感染因子的抗体

研究人员希望为广泛的疾病开发疫苗，治疗和新的诊断测试。要做到这一点，他们需要更好地了解一类关键的生物成分。被称为表面膜蛋白，疾病过程中的这些重要成分形成了结构和功能上多样化的巨大复杂性组合。

在一项新的研究中，亚利桑那州立大学生物设计研究所的研究教授黛布拉汉森探索了一种研究由一对高致病性生物体产生的膜蛋白的创新方法。该研究小组表明，基于DNA的遗传免疫，使用一种称为基因枪的装置，可以在小鼠中成功表达膜蛋白，并诱导动物产生一系列针对细菌和病毒靶标的关键抗体。

“我们了解到我们的新抗体生产过程非常有效。如果膜蛋白天然具有免疫原性，我们很容易仅使用基因产生高水平的抗体，”Hansen说。“在免疫接种之前，我们让免疫接种的宿主为我们工作，而不是费力地净化膜蛋白并试图在洗涤剂中保持适当的蛋白质结构。”

该新研究还描述了一种在试管中表达和纯化膜蛋白并检测它们与从基因免疫小鼠中提取的血液中的特异性抗体的结合活性的方法。

通常，产生对外来蛋白质的免疫应答需要纯化蛋白质，然后将其注射到动物体内。该过程繁琐，具有挑战性且耗时。在目前的研究中，通过直接引入编码目的蛋白质的基因产生免疫应答。

通过重组DNA的过程，研究中产生的两种膜蛋白也被成功地引入细菌大肠杆菌的膜中。使用来自基因免疫小鼠的血液中存在的特异性抗体首次证明两种膜蛋白可以在活生物体中重组表达，正确折叠成适当的3-D结构并迁移到大肠杆菌内的膜上。这些结果现在有助于这两种关键毒力蛋白的结构测定。

这项研究发表在最新一期的自然出版集团期刊“ 科学报告”中，有望为对医学至关重要的膜蛋白的结构和功能提供新的见解。

在表面上

膜蛋白涉及生物体中的无数功能，包括细胞信号传导和通信，能量转换和利用，分子运输和催化。由于他们参与了一系列疾病，他们最近成为新一系列治疗方法的主要目标。实际上，超过50%的治疗靶标是膜蛋白。随着对膜蛋白结构和功能的了解越来越多，预计这一数字将会上升。

尽管它们在宿主/病原体相互作用以及药物/细胞关系中作为分子界面具有重要作用，但膜蛋白在目前编目的100,000个独特蛋白质结构中占不到1%。这主要是由于生产，纯化和确定膜蛋白结构所涉及的严重挑战。Hansen和她的同事概述了生产抗体特异性蛋白质的新策略，这些蛋白质由免疫系统自然产生，以应对病原体或其他威胁生物制剂。

在目前的研究中，他们描述了使用基因枪将DNA信息引入小鼠。手持设备使用一股气体将含有称为质粒的环状DNA浸渍的金颗粒推入小鼠皮肤。金颗粒被称为微纳米复合物。基因枪技术由生物设计医学创新中心的联合主任Stephen A. Johnston开创并开发。

通过基因枪引入的遗传物质被小鼠树突细胞摄取并在真皮组织和淋巴结中翻译成膜蛋白。小鼠免疫系统通过产生能够结合膜蛋白的特异性抗体来响应。虽然遗传免疫的基本技术已经使用了一段时间，但该研究首次描述了这种方法对膜蛋白的广泛适用性，以及DNA-金微纳米复合物首次应用以刺激抗体产生。

检查了细菌和病毒威胁

结果显示，基因免疫成功地产生了来自两种生物安全3级病原体的17种膜蛋白中的12种特异性抗体：土拉弗朗西斯菌和非洲猪瘟病毒(ASFV)。F. tularensis引起疾病tularemia。它是一种广泛研究的传染性病原体，因其能够侵入多种细胞类型并巧妙地逃避免疫系统而臭名昭着。它是地球上最致病的细菌之一，只能通过10个细胞引起致命的感染。非洲猪瘟病毒由节肢动物携带。猪的感染导致致命和无法治愈的出血性疾病，这种疾病已经破坏了非洲和东欧地区的猪群。

对这些生物体产生的内源性疾病蛋白质的研究很困难，需要专门的安全设施和方案，因为它们可能给研究人员带来危险。所描述的新方法允许通过基于DNA的方法产生这些病原体的膜蛋白和相关抗体，允许安全处理生物材料而没有感染风险。

一旦在小鼠中产生了针对特定膜蛋白的抗体，该组试图表征所得的小鼠血液或血清。为此，开发了在疏水性磁珠(IVT-HMB)存在下称为体外翻译的新系统。在此，在试管中产生小质量的膜蛋白，同时使用疏水珠提取，然后针对从基因免疫的小鼠中提取的血清进行筛选。在两种类型的诊断测试或测定(ELISA和蛋白质印迹)中检测所得信号确定了在小鼠血清中存在对每种膜蛋白特异的抗体。IVT-HMB方法代表了膜蛋白生产的强大精简，排除了传统上需要的艰苦的分离和纯化过程。

踏脚石到蛋白质结构

使用X射线成像微小的蛋白质晶体是确定详细蛋白质结构的有效方法，但该技术面临许多挑战，包括难以生产和纯化正确组装的蛋白质。目前的研究标志着膜蛋白进一步结构表征的起点，使用冷冻EM和X射线晶体学等技术。

新研究的共同作者，生物设计研究所应用结构发现中心的主编Petra Fromme强调了这项新研究的力量：“通过遗传免疫等技术产生的抗体范围打开了高分辨率分子图像的大门重要的膜蛋白，“她说。“由此产生的抗体有助于以各种重要方式进行结构测定，识别正确组装的蛋白质，帮助诱导蛋白质与其他蛋白质组装成有序的晶体，并稳定或捕获可以使用X射线成像的活跃状态的蛋白质。”

在下一阶段的研究中，该小组计划使用相同的免疫程序生产单克隆抗体。这些作为共结晶结合因子或配体是必需的，用于通过X射线晶体学结构测定膜蛋白。作者进一步指出，通过基因免疫技术产生的单克隆抗体为未来针对广泛疾病的治疗提供了有吸引力的候选者。

这项研究由生物设计研究所的教师共同完成，包括来自医学创新中心(CIM)的Debra Hansen，应用结构发现中心(CASD)和分子科学学院(SMS)，来自CIM的Kathryn Sykes和来自CASD和SMS的Petra Fromme，以及他们的研究人员和学生团队，包括：研究科学家Mark Robida，Andrey Loskutov和Tien Olson，研究员Felicia Craciunescu，John-Charles Rodenberry和Hetal Patel以及来自CIM和博士后Katerina的研究生Xiao Wang来自SMS的Dörner。

用于应用该方法的所有必需克隆(质粒DNA)可通过DNASU Plasmid Repository获得，该DNA存储在Biodesign的个性化诊断中心。