新的SLENDR技术 通过基因组编辑在发育中的大脑中进行蛋白质标记

Ryohei Yasuda博士及其团队开发了一种名为SLENDR的方法，可以精确修饰活体样本中的神经元DNA。利用他们的新技术，研究团队能够在同一细胞中可靠地同时标记两种不同颜色的不同蛋白质。研究人员使用各种成像方法以及DNA测序来确认SLENDR方法真正准确地敲除了基因。

Ryohei Yasuda，Ph.D。他在马克斯普朗克佛罗里达神经科学研究所(MPFI)的团队正在努力了解我们学习和形成记忆时大脑细胞的变化方式。但由于缺乏允许科学家在单个神经元内定位和可视化单个蛋白质的技术，该领域的研究受到限制。目前的成像方法不能提供足够强的特异性，对比度和分辨率来观察不同的蛋白质。此外，它们耗时且昂贵; 开发工程模型可能需要一到两年的时间。但是当研究员Jun Nishiyama，医学博士和博士后研究员，以及Takayasu Mikuni，医学博士，博士，阅读关于CRISPR / Cas9，一种突破性的DNA编辑技术，在2014年开发，他们有一个理念。

CRISPR是一种内置于细菌DNA中的工具，单细胞生物用它来对抗感染。当病毒侵入并试图将其感染性DNA插入细菌细胞时，细菌DNA的一个特殊区域(称为CRISPR)会切割病毒DNA并使其无法造成严重破坏。科学家们已经开始使用CRISPR / Cas9来破坏除细菌以外的细胞和生物中的特定基因。当这种损害发生时，细胞用两种方法修复其DNA。一种是同源定向修复(HDR)，另一种是非同源末端连接(NHEJ)。HDR更加精确，可以重建或替换受损基因，而NHEJ可以降解受损基因并重新附着剩下的末端，通常会删除受损基因的表达，但不会替换它。

如果细胞使用HDR进行自我修复，科学家可以在CRISPR系统中包含一个所需的基因，该基因将插入DNA中以替换受损基因。许多研究人员认为，一旦细胞停止分裂，它通常使用NHEJ而不是HDR来修复任何破碎的DNA。尽管CRISPR系统具有令人印象深刻的能力，但在脑细胞中操纵DNA几乎没有成功，因为在大脑形成的时候，它的细胞不再分裂。虽然科学家可以相对容易地使用CRISPR来敲除大脑中的某些基因，但细胞分裂的缺乏使他们很难通过HDR以可靠的精确度敲入所需的基因。

Yasuda和他的团队开发了一种方法，他们称之为SLENDR(通过CRISPRCas9介导的同源定向修复对内源蛋白进行单细胞标记)，可用于精确修饰活体样本中的神经元DNA。在实验模型中，该团队用于子宫内电穿孔，这种技术允许他们将CRISPR / Cas9系统插入仍在发育和分裂的产前脑细胞中。因此，破碎的DNA仍然通过HDR进行修复，使研究人员能够在显微镜下添加一种可以使目的蛋白质可见的基因。他们甚至能够在同一细胞中同时可靠地标记两种不同颜色的不同蛋白质。研究人员使用各种成像方法以及DNA测序来确认SLENDR方法真正准确地敲除了基因。在测试新技术的同时，研究小组观察到蛋白激酶C的α同种型之前未被描述的行为。在发育早期，出生后约7天，发现它聚集在细胞膜上，表明它是高度活跃的，而在出生后一个月，它在整个细胞中弥漫性扩散，表明它在发育后期不会保持高度活跃。

“我相信SLENDR将成为分子和细胞神经生物学的标准工具，”Yasuda说。“SLENDR为确定蛋白质的亚细胞定位提供了有价值的手段，并将帮助研究人员确定蛋白质的功能。”