基于CRISPR的单细胞遗传学平台可以快速分析关键基因网络

来自加州大学旧金山分校和麻省理工学院和哈佛大学的研究所的研究人员已经开发出一种新方法，用于对复杂的遗传相互作用进行高通量功能筛选，并在单细胞中产生表型，他们将其称为“Perturb-seq”。这些发现可以大大加快科学家绘制基因相互作用和对环境刺激的反应的能力，从而促进对健康基因网络的理解以及它们在疾病背景下如何出错。

在12月15日出版的Cell杂志上发表了两篇合着论文，其中一篇由Broad研究所研究人员领导，另一篇由UCSF研究人员领导，Perturb-seq平台使用单细胞RNA测序来测量许多基于CRISPR的扰动的影响。在大量的细胞上。该方法可用于许多实验应用，例如比以前可能更有效地探索基因组研究中遗传风险因子的功能影响，或者观察癌细胞中突变的基因。

通过协作，Broad和UCSF团队使用Perturb-seq分别对树突状细胞中的免疫反应，免疫系统中作为关键信使的细胞类型以及未折叠的蛋白质反应(细胞应激)进行了新的发现。与许多神经退行性疾病有关的途径，证明该平台有可能产生对各种生物学问题的洞察力。

“在perturb-Seq中，我们将汇集的CRISPR筛选与基于液滴的单细胞RNA测序的信息丰富的读数结合起来，为我们提供了一个强大的工具，可以显着增加我们从功能基因组筛选中学到的关于电路如何学习的范围广泛领导的研究的高级作者，麻省理工学院的生物学教授，Broad的核心教员，霍华德休斯医学研究所的研究员，Aviv Regev博士说。“特别是，我们可以理解'整体是如何大于其各部分的总和'，也就是说，为什么将两个不同的基因混合在一起会产生不同于单独扰动它们的效果。这将有助于我们更好地预测当我们开发治疗方法时，我们会以疾病为目标。“

“Perturb-seq带来了两项技术进步 - 基于CRISPR的扰动和大规模并行单细胞RNA测序 - 我们认为这将极大地加速我们理解编码细胞组分的不同基因如何通常连接在一起的能力加州大学旧金山分校的细胞和分子药理学教授，霍华德休斯医学研究所的研究员，以及加州大学旧金山分校领导的研究的高级作者乔纳森韦斯曼博士说，这是人类疾病出了什么问题。

还采用了强大的细胞条形码策略的设计，使研究人员能够识别事后在合并实验中对细胞进行的特定扰动，同时测量这些扰动对细胞中mRNA转录物的影响。 。在进行实验性处理(例如免疫刺激或细胞应激)后，可以对细胞进行基于液滴的单细胞RNA测序，以读出转录谱和条形码的同一性。通过索引细胞的mRNA和条形码同一性，每个细胞的转录谱与传递给它的一个或多个遗传扰动相关。

“功能基因组学研究可以揭示基因型和表型之间的联系，但我们也想了解两者之间的机制关系，”广泛领导的研究的共同第一作者，研究生Atray Dixit说。麻省理工学院。“观察RNA水平是一个很好的起点。”

在广泛领导的实验中，研究人员使用CRISPR / Cas9核酸酶切割DNA并使参与树突状细胞免疫应答的转录因子蛋白(TF)的基因失活，并使癌细胞系中TF和细胞周期调节因子的基因失活。 。Perturb-seq准确地鉴定了受个体基因修饰影响的个体基因靶标，基因特征和细胞状态，并探索了这些基因如何相互作用和相互依赖。

“在过去，功能性屏幕必须在测量由许多扰动引起的简单表型变化之间进行选择，或者在有限数量的扰动中采用丰富，高分辨率的观察，”Oren Parnas博士说，他的共同第一作者广泛领导的研究，曾是Broad研究所的博士后研究员，目前是耶路撒冷希伯来大学医学院的研究员。“有了Perturb-seq，我们可以在两端扩大实验范围。”

在UCSF主导的实验中，研究人员使用基于CRISPR的转录干扰(CRISPRi)同时抑制癌细胞系中的三个基因并研究未折叠蛋白反应(UPR)，这是一种众所周知的质量控制途径，可以感知压力在内质网(ER)中，许多细胞的关键蛋白质被制成。UPR检测细胞蛋白质生产机器中的错误，并确保受损细胞自我毁灭。

在全基因组CRISPRi筛选中鉴定出数百个功能由UPR监测的基因后，由UCSF领导的团队应用Perturb-seq以单细胞分辨率查询这些基因的一个子集，使研究人员能够系统地揭示这些关系在基因之间解剖细胞对ER应激反应的复杂方式。

“通过单细胞RNA测序得到的无偏读数，我们可以在没有事先假设的情况下发现有关生物途径的信息，”加州大学旧金山分校领导的研究的共同第一作者，博士后研究员Tom Norman博士说。魏斯曼实验室 “它开辟了新的可能性，从更有针对性的研究中可能并不明显。”

Perturb-seq方法可用于研究致病等位基因的功能效应，并可大规模探索可以修改以逆转这些效应的其他目标。该方法也很有效，因为它允许同时研究几种扰动，这可以为寻找癌症中的联合疗法提供信息。

“通过共同努力建立核心技术，然后同时努力评估Perturb-seq和基于CRISPR的方法来灭活或抑制生物学不同领域的基因，我们的团队能够迅速证明该系统具有广泛的适用性，”加州大学旧金山分校领导的研究的共同第一作者，Weissman实验室的博士后研究员Britt Adamson博士说。“Perturb-seq不仅限于一种类型的CRISPR介导的扰动，这一事实应该令人难以置信，并允许其他研究小组利用这种新方法。”

研究人员表示，他们希望这两项细胞研究能够成为他们新平台的有力例证，随着单细胞测序技术的进步和未来的强大功能，Perturb-seq可能会变得更加容易和快速，日益强大的研究可以揭示基因及其在健康和疾病中的相互作用。