一种新的工具 用于基因工程最古老的生命分支

伊利诺伊大学Bill Metcalf的微生物学教授G. William Arends与博士后研究员Dipti Nayak进行的一项新研究首次记录了CRISPR-Cas9介导的基因组编辑在生命的第三个领域Archaea中的应用。他们在美国国家科学院院刊上发表的开创性工作有可能大大加速这些生物的未来研究，对包括全球气候变化在内的研究产生影响。Metcalf和Nayak是伊利诺伊州Carl R. Woese基因组生物学研究所的成员。

“在大多数情况下，与大肠杆菌相比，我们的模型古菌Methanosarcina acetivorans的倍增时间为8到10小时，大肠杆菌可以在30分钟内翻倍。这意味着做遗传，获得突变体，可以采取几个月 - 同样的事情在大肠杆菌中需要三天，“Nayak解释说。“在一个非常基础的层面上，CRISPR-Cas9使我们能够做的是加速整个过程。它消除了一个主要的瓶颈......在与这个古菌进行遗传学研究时。“甚至更多，”Nayak继续说道，“通过我们以前的技术，突变必须一步一步地引入。使用这种新技术，我们可以同时引入多个突变。我们可以扩大突变体生成过程的指数级与CRISPR。“

CRISPR是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats的缩写，最初是古细菌和细菌的免疫防御系统。通过识别和储存外源DNA的短片段，Cas(CRISPR相关系统)蛋白能够在将来快速识别该DNA，从而可以迅速将其破坏，保护机体免受病毒入侵。

自发现以来，该免疫系统-TXF-Cas9的一个版本已经过修改，可以在实验室中编辑基因组。通过将Cas9与特异性工程RNA导向而非侵入性DNA片段配对，可以指导CRISPR系统在任意位置切割细胞的基因组，从而可以移除现有基因或添加新基因。该系统在编辑从酵母，植物，鱼类甚至人类细胞的真核系统方面具有丰富的经验，并获得了美国科学促进会2015年度突破奖。然而，它在原核物种中的实施遇到了障碍，部分原因在于其不同的细胞过程。

为了在细胞系统中使用CRISPR，研究人员必须开发一种方案，该方案考虑了细胞优选的DNA修复机制：在CRISPR的“分子剪刀”切割染色体后，细胞的修复系统通过一种机制介入以修复损伤。可以利用去除或添加其他遗传物质。在真核细胞中，这采用非同源末端连接(NHEJ)的形式。虽然这种途径已被用于CRISPR介导的编辑，但它有在其修复过程中引入遗传错误的趋势：核苷酸，DNA梯的梯级，通常在切割位点添加或删除。

NHEJ在原核生物中非常罕见，包括古细菌; 相反，他们的DNA通常通过称为同源定向修复的过程进行修复。通过比较DNA模板的损伤，同源定向修复创造了Nayak所谓的“确定性模板” - 最终结果可以提前预测并根据研究人员的确切需求进行调整。

在许多方面，同源定向修复实际上更适合基因组编辑：“尽管我们希望CRISPR-Cas9在真核系统中进行定向编辑，但由于NHEJ，我们常常得到我们不想要的东西，” Nayak解释道。“在这方面，大多数古菌菌株不具有非同源末端连接修复系统是一件好事，因此DNA可以修复的唯一方法是通过这种确定性的同源修复途径。”

虽然看似违反直觉，但Nayak和Metcalf首次使用CRISPR-Cas9之一是在Methanosarcina acetivorans中引入NHEJ机制。Nayak说，虽然一般不喜欢基因组编辑，但NHEJ有一种用途，它优于同源修复：“如果你只是想删除一个基因，如果你不关心如何...非同源末端连接实际上更高效。”

通过使用引入的NHEJ修复系统进行所谓的“敲除”研究，其中单个基因被移除或沉默以查看产生的变化以及该基因可能影响的过程，Nayak说未来的研究将能够组装M. acetivorans和其他古菌种的遗传图谱。这样的地图集对于涉及古细菌的各种研究领域非常有用，包括Metcalf实验室特别感兴趣的领域，即气候变化。

“Methanosarcina acetivorans是最易遗传的古菌菌株之一，”Nayak说。“[产甲烷菌]是一类古菌，每年产生这种强效温室气体的千兆吨，在全球碳循环中发挥着重要作用，因此对全球气候变化做出了重大贡献。” 通过研究这种和类似生物的遗传学，Nayak和Metcalf希望不仅能够更深入地了解古生物遗传学，还希望它们能够在更广泛的环境过程中发挥作用。

总之，这项研究代表了研究和操纵古菌的一个令人兴奋的新方向。“我们开始这项研究，以确定是否有可能在古细菌中使用CRISPR-Cas9基因组编辑，”Nayak总结道。“我们发现它不仅是可能的，而且与真核系统相比，它的效果非常好。”