通过纳米孔的1000美元基因组之路

我们即将在医生办公室的手持设备上快速测序小血样的那一天。通过分析您的DNA，您的医生将获得关于您当前健康状况以及您将来可能易受伤害的疾病的重要信息。

能够进行这种快速可靠测序的第三代DNA测序装置已经开发多年。一些设备能够检测和读取DNA分子，因为它们被驱动通过纳米孔，只有2纳米或约十亿分之一米的微小孔，可以区​​分组成的四个碱基的独特电子信号DNA：腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶和鸟嘌呤。第一批基于纳米孔的DNA测序装置预计将于2014年上映。

众所周知，纳米孔测序只是国家人类基因组研究(NHGRI)受赠者目前正在追求的许多有前途的技术之一，以实现1000美元或更低的高质量人类基因组测序。

NHGRI于2004年启动了这项工作，并获得了其高级DNA测序技术计划的首批拨款。

当时，Sanger测序可以使用100台机器生产高质量的人类或其他哺乳动物基因组草图，持续3到4个月，耗资2000万美元。人类基因组计划使用了Sanger测序。

该计划的最初五年目标是开发第二代或下一代(NextGen)测序技术，这可以将人类基因组测序的成本降低两个数量级至100,000美元。由于NHGRI计划以及其他学术和私人努力，该计划目标得以实现并超越。这些努力使得使用较少的第一代测序仪所需的昂贵化学试剂的技术小型化。更重要的是，新技术能够同时读取数百万次而不是数百次测序反应。

今天在实验室中使用的NextGen DNA测序技术可以在一周内在一台机器上对人类基因组进行测序，因为这些机器每次处理大约10亿个样品。每个基因组的成本降至约20,000美元。

尽管最近媒体报道称1000美元的基因组不可避免，并且最早可能在今年发生，但仍存在困难的障碍。尽管如此，纳米孔测序显示出大幅削减测序成本的巨大希望。除了其他优点之外，它需要很少或不需要化学试剂或昂贵的光学系统来检测许多当前NextGen装置采用的DNA碱基。

“几年来，科学家和工程师一直对使用纳米孔作为低成本DNA测序问题解决方案的潜力感兴趣，”NHGRI技术开发项目总监Jeffery Schloss博士说。“最终，我们希望这些设备能够从组织或血液样本中分离DNA并快速测序非常长的DNA分子。这些电子设备使用简单，价格低廉，可以直接连接到收集和整理数据的计算机上。 “

根据Schloss的说法，获得成本非常低的基因组的承诺将使DNA测序成为常规的临床测试，就像今天作为医疗保健常规部分进行的血液测试一样。而对于生物医学研究人员来说，低成本将允许数千名患有疾病的人的基因组序列与来自健康个体的基因组序列进行比较。以这种规模对基因组进行测序的能力将允许对诸如糖尿病，精神健康障碍和心脏病等多种疾病进行前所未有的理解。

研究人员正在采取各种方法来克服实现纳米孢子DNA测序的其余障碍。一些研究人员正在开发使用蛋白质或天然纳米孔的方法，因为它们具有原子级精确性。换句话说，它们的直径非常接近DNA的大小，并且纳米孔的内部形状和电荷可以通过化学和遗传方式进行操作以执行新功能 - 例如识别每个DNA碱基 - 这与它们的不同在自然中做。

由Hagan Bayley博士和他在英国牛津大学的同事开发的测序方法依赖于来自细菌金黄色葡萄球菌的膜蛋白的天然蛋白质纳米孔，称为α-溶血素。在2010年9月8日的Nano Letters杂志上，他们报道了他们修改了纳米孔中的三个点之一，这些点允许DNA碱基在通过纳米孔时被准确识别。

接下来的一周，在美国国家科学院院刊中，由阿拉巴马大学伯明翰分校的Michael Niederweis博士和西雅图华盛顿大学的Jens Gundlach博士领导的研究小组对各个核苷酸进行了区分。使用不同的蛋白质纳米孔，来自细菌的粪类中的孔蛋白A蛋白，耻垢分枝杆菌。该组对纳米孔进行遗传修饰以检测单个DNA亚基。

除了测序DNA之外，基于纳米孔的装置可能能够对DNA分子进行其他分析。例如，这些装置可能能够区分表观基因组中的DNA甲基化模式，DNA在正常发育中起重要作用的化学标记以及癌症等疾病。Bayley的研究小组在2010年11月21日发表的“ 化学通讯 ”杂志上报道，他们的蛋白质纳米孔(其碱基鉴别位点已被修饰)可以识别表观遗传DNA修饰。

蛋白质纳米孔并非没有问题。“在自然界和开发这项技术的实验室中，蛋白质纳米孔位于脂质双层(制造细胞膜的材料)中，这往往是脆弱的，容易被破坏，”Schloss说。“然而，Bayley和Gundlach以及其他使用蛋白质纳米孔的人正在采用优雅的解决方案来解决这些问题。”

其他团体正在制造钻入绝缘材料中的人造或固态纳米孔。几个小组正在使用原子级薄石墨层(称为石墨烯)来制造固态纳米孔。石墨烯特别有趣，因为它可以用作纳米孔和电连接，使得构建测序装置更容易。石墨烯片也足够薄以满足查询DNA链内单个DNA亚基的要求。

Jene Golovchenko，博士，Daniel Branton，博士，以及他们在哈佛大学和麻省理工学院的同事，报告了2010年9月9日问题中首次通过石墨烯纳米孔传输DNA的示范之一的性质。石墨烯片分隔两个含有液体溶液的腔室。研究小组表明，当DNA分子通过这些纳米孔时，可以检测到它们，因为它们可以阻止液体腔室之间的离子流动。

另一种测量纳米孔中DNA碱基的潜在策略称为电子隧穿。该概念涉及在由小间隙分开的两个电极之间流动的电流。该隧穿电流对电极之间的距离敏感，并且当分子置于电极之间时，电流改变并且可能潜在地用于识别分子。

来自亚利桑那州立大学的Stuart Lindsay博士及其同事已经证明，使用电子隧道技术可以识别出作为较大链的一部分的单个DNA碱基。他们在2010年12月出版的“ 自然纳米技术”杂志上发表的论文描述了使用附着在电极上的化学“指状物”，从一个微小间隙的两侧指向通过它们之间的DNA链。这些手指短暂地识别每个碱基并允许电流通过，区分四个DNA碱基。

“自纳米孔测序研究开始以来，人们设想了两种检测模式。其中一种，离子将流过与DNA平行的孔隙，不同的DNA碱基会在不同程度上阻断离子，从而可以识别每种离子。基础身份，“Schloss说。“第二种模式是隧道效应，其中电流穿过孔隙，穿过各个基底。这是隧道探测对DNA链中包含的单个核苷酸起作用的第一个证明。但是，仍然存在许多挑战。寻求建立一个强大的电子隧道DNA测序装置。“

无论使用哪种纳米孔或测量方案，必须解决的一个问题是控制DNA分子通过纳米孔移动的速度，称为易位，因此它减慢到单个碱基存在足够长的程度被认可。

Xinsheng Sean Ling，Ph.D。位于罗德岛普罗维登斯的布朗大学的同事正在开发一种固态纳米孔方法，该方法使用称为探针的已知DNA序列的短片段，其与沿着待测序的较长DNA分子的相应碱基对匹配。Ling的研究成果发表在2010年8月20日的纳米技术杂志上，结果表明，当DNA被电场拉入纳米孔时，附着在DNA上的塑料珠会产生阻力，从而减缓DNA的易位。

其他人正在研究在纳米孔的开口处放置DNA聚合酶(一种通常参与细胞中DNA复制的酶)的功效。聚合酶捕获DNA分子并充当各种分子棘轮扳手，允许DNA聚合物一次前进一个核苷酸通过纳米孔。在这种工具的帮助下，每个DNA碱基将保留在纳米孔内的关键位置，持续一段时间，以毫秒为单位 - 足够的时间进行鉴定。

加利福尼亚大学圣克鲁兹分校的Mark Akeson博士及其同事最近在2010年11月发表在Nature Nanotechnology和Journal上的论文中，使用三种不同类型的DNA聚合酶，在时间易位控制中证明了单碱基。美国化学学会于2010年12月22日报道。第一篇论文报道了用于将DNA拉入孔中的快速电子器件的精确控制，以便与允许DNA移动的酶的活性达到平衡。一次一个DNA亚基。第二篇论文讨论了允许使用更简单的电子学的不同酶。

在2010年1月发表在Nano Letters的 ASAP页面上的一篇文章中，Bayley的小组通过基因工程设计了“分子制动器”，这是一种缩短DNA转位速度的蛋白质纳米孔的狭窄通道。

NHGRI资助的研究人员和团队的所有进展以及其他实验室的相关工作正在为纳米孔DNA测序技术的发展做出重大贡献。最后，Schloss指出，进入诊所的纳米孔平台和设备可能会使用各种技术。他预测，如果将这些技术整合到强大的系统中，他们有朝一日可能会改变生命科学和医学实践。