Nature综述丨冷冻电镜在药物发现中的应用前景

　　1 前言

　　近日，欧美多国科学家在Nature Reviews Drug Discovery杂志发表了题为Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects的重要综述，系统阐述了Cryo-EM(Cryo-electron microscopy)的前世今生，以及它在药物筛选方面的应用前景【1】。

　　众所周知，2017年诺贝尔化学奖授予了三位杰出的生物物理学家Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson，以表彰他们在Cryo-EM发展过程中的推动性贡献。有了他们，众多生物学家的工作才如行云流水，探囊取物似的发文(特约评论丨2017年诺贝尔化学奖评述——冷冻电镜技术获奖并不意味着该技术已经成熟)。

　　结构生物学似乎一直被很多人，甚至被很多“吃瓜群众”所诟病。不少人认为结构生物学就是“灌水+搬砖”，觉得结构生物学领域发高水平文章很容易，其实不然。外行看结构生物学，可能大部分仅停留在结构表面，对结构生物学的应用和对科学问题的阐述缺乏深入的了解和认识。颜宁老师曾说过，“拿到一个结构只是一个起点，从结构里去发现大自然的奥秘才是结构生物学的精髓所在!”

　　其实结构生物学的重要性毋庸置疑，这一点可以从近几年(如2003、2006、2009、2012)的诺贝尔奖直接授予结构生物学家看出。这些诺贝尔奖获得者也并非一直从事结构生物学研究，比如说2012年诺贝尔化学奖得主Brian K. Kobilka最初从事细胞生物学，后来转行从事结构生物学研究分子机制 (https://www.nature.com/-news/2011/110824/full/476387a.html)，因为他觉得他的科学问题只有结构生物学才能解答，才能从原子水平解释G蛋白偶联受体(GPCR)的分子机理。另一方面，结构生物学在药物筛选中也起着举足轻重的作用。

　　2 三足鼎立的时代

　　目前的结构生物学的三大手段分别是X-ray晶体衍射、核磁共振(NMR)和Cryo-EM。X-ray晶体衍射在这三种方法中一直是占主导地位，在PDB数据库中，晶体结构大约占总数的90%，NMR结构占9%，剩下EM结构仅占不到1%(图1)。尽管如此，这三种技术各自有各自的优势和地位。

　　X-ray晶体衍射主要覆盖的蛋白分子大小在10-150 kd，超过150 kd的晶体结构非常少，不过大部分蛋白都在这个分子量范围内。该技术经过几十年成熟的发展，已经解析了12万多个蛋白结构，如今想找一个容易结晶的重要蛋白可不易。

　　NMR技术主要覆盖的蛋白分子小于50 kd，可以直接对溶液中的蛋白进行结构解析;不过它对蛋白的表达量和稳定性要求很高，所以可以继续深入发掘的潜力有限。

　　Cryo-EM技术近些年来才兴起，经过近几年的飞速发展，倒是大有取代X-ray晶体衍射方法之势【2-4】(0.73埃，最高分辨率的结构揭示淀粉样聚集蛋白功能性可逆的精密调控分子机制)。不过目前来说，Cryo-EM的蛋白结构主要是大于150 kd的大蛋白或复合物，而且分辨率3 埃以下的还是少数，但是这一现状正在改观。

　图1. 结构生物学三种方法解析的结构比例

　　3 结构生物学在药物筛选中的应用

　　结构生物学一直在药物设计中扮演着重要的角色，它可以用于临床前药物设计的每一步，包括药物靶点的设计和鉴定，先导化合物优化等。由于能提供直接的证据，所以往往在筛药初期，可以对药物设计提供可靠的靶点，为小分子药物指明方向;在后期，直接提供结构生物学的证据，起到画龙点睛的作用。

　　结构生物学的三大方法对药物设计均有很大的帮助，但是也各自有各自的优缺点。X-ray晶体学是目前来说最高效、最强大，也是实际作用最大的方法，当靶点是可结晶的蛋白，一旦强大的结晶系建立，就可以快速和可重复地产生高分辨率结构，就可以源源不断的对蛋白进行位点突变或药物设计了;核磁共振(NMR)允许快速识别和分类，并提供有关系统动态的信息，但是该方法本身受到很多因素的限制，比如目标蛋白的覆盖范围不是特别广泛;Cryo-EM允许在溶液中确定大的和/或动态的大分子复合物的结构，而不需要获得晶体，甚至在它们的天然状态下即可实现，比如翻译后修饰的状态;此外，由于蛋白在接近天然状态下的溶液中是高度动态的，所以蛋白的不同构象状态可以在一个实验中解决。

　　Cryo-EM已经证明了其在靶标鉴定、验证等方面的实用性，通常涉及目标结构分析，以理解作用机制和评估可药用性。该分析需要参考天然的结构，理想情况下会结合其他方法的结果作为参考。自20世纪90年代以来，Cryo-EM已与X-ray晶体学结合使用了几十年，以解决不易结晶的大型复合物的结构。从EM密度图的轮廓获得的低分辨率分子包络(通过使用与对象的分子质量相关的阈值以去除与噪声对应的三位像素)可以给高分辨率晶体结构域、个别蛋白质或复合体提供近似轮廓，可与X-ray晶体学相辅相成。

　　结构生物学在药物开发中的应用，最好的例子当属GPCR了【1, 5, 6】。在2007年GPCR结构解析之前，药物筛选基本上就是处在盲筛和半盲筛的阶段。有了晶体结构之后，临床药物的开发迅速发展，上市药物也全面发展(图2)。

图2. a.近年来GPCR的临床阶段中的药剂数量;b. 每种受体配体类型在所有结晶GPCR中的比例 【6】

　　4 Cryo-EM技术的历史与现状

　　1931年，Max Knoll和Ernst Ruska发明了电子显微镜，并在1933年第一次打破了光镜的理论极限，使人类能够看到更加细小的颗粒。在发明之初，电镜并不被看好被用于对生物样品的观测。因为两个基本的问题摆在生物学家面前：一是电镜成像时，需要在真空中;二是成像时电子的辐射对生物样品的损伤很大。所以在之后的几十年里，科学家仅仅是用它做一些细胞形态学、病毒颗粒之类的负染，除此外，电镜在生物领域的贡献不太大。

　　但是技术瓶颈总是阻挡不住科学家求真的脚步!1981年，Jacques Dubochet和他的同事在电镜技术上取得了突破性进展——他们将快速冷冻的方法引入其中，即，将单个分子快速冷冻在单层的玻璃态的水(或者叫无定形的冰，vitrified water)中，即可解决上述两个基本问题。玻璃态化(Vitrification)的过程不仅可以使样品保持天然的状态，还可以保护样品在低温成像时免受脱水的危险，而冷冻本身也减少了由电子束引起的伤害。

　　尽管如此，在当时，要使电镜成像达到原子分辨率水平，还依然面临诸多挑战。比如说低信噪比、如何将2D成像转化为3D结构等问题。Joachim Frank和他的同事率先使用计算图像处理技术(computational image processing techniques)，利用多个成像生物大分子拷贝的计算平均来改善信噪比的问题，得到不同角度的2D图像，再利用计算机软件进行3D重建，解析蛋白质的结构。近些年来众多的设备改善也极大促进了Cryo-EM技术的发展，比如高自动化程序的软件开发、高性能charge-coupled device(CCD)相机的应用等。正是由于这些技术的使用，Cryo-EM的应用才越来越广泛。

　　从电镜发明开始至今，解析的生物样品的结构大约有2200个(蛋白结构、病毒颗粒等)。1968年，第一个电镜结构被解析;1981年，有了冷冻样品的电镜技术;1999年，使用电镜技术解析的ribosome分辨率达到7.5 埃 【3】。大约2000年之后，电镜结构的数量开始逐年增长，但那时的分辨率一直不佳;而在2010年之后，用电镜技术解析的生物样品结构开始井喷式增长，2010年首次超过50个，分辨率也接近原子分辨率或近原子分辨率。目前总量已经接近2200个(图3) 。相信未来增长的势头会更加迅猛。

图3.Cryo-EM结构增长情况。数据来源于PDB数据库，截至2018年6月13日)

　　5 Cryo-EM技术在药物筛选中的应用前景

　　最近，单颗粒Cryo-EM为不适合结晶的蛋白提供了高分辨率结构，包括大型动态复合物和膜蛋白，技术进步使得Cryo-EM可用于研究更小的物体和分辨率更高的物体，包括与小分子的复合物。本节将通过几个例子重点介绍具有药物发现相关性的Cryo-EM结构。

　　5.1膜蛋白

　　GPCRs。GPCRs是最丰富的细胞表面受体蛋白，并且被市场上约30%的药物所靶向 【5, 6】。尽管GPCR的X-ray晶体学研究取得了重大进展(这在历史上一直是非常具有挑战性的)，但由于需要获得高质量晶体和纯化过程中相对较低的稳定性，X-ray对该家族的一些成员仍然难以应付。然而，cryo-EM可以确定GPCRs的不同构象以及与G蛋白复合物的结构，从而用于配体筛选或设计药物。以前，构象不稳定且不能结晶的大复合物无法成像，Cryo-EM则使其成为可能。2016年，单颗粒cryo-EM解析了第一个GPCR的cryo-EM结构(4.1埃)，确定了激活状态下鲑降钙素、G蛋白和人降钙素受体(B类GPCR)的异源三聚体结构【7】。此后不久，结合兔胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide 1, GLP1)、G蛋白和GLP1受体(B类GPCR)4.1 埃的cryo-EM结构被解析，解释了B类受体如何通过激素活化结合【8】。人类GLP1受体结合的激动剂和G蛋白异源三聚体的3.3 埃的Cryo-EM结构，给出了偏向激动作用(biased agonism)的见解【9】(图4)。分子量为150 kDa时，这种重要的药物靶点曾经被认为几乎不可能在近原子分辨率下使用cryo-EM成像，直到最近这些GLP1受体结构被解析出来。这些结构侧链清晰可辨，可帮助设计治疗II型糖尿病和肥胖症的新药，同时也为以后的更高分辨率GPCR蛋白复合物的解析提供了很好的样本范例。

　图4. 偏向信号(Biased signalling)可以通过三种通用机制进行编码【5】

　　γ-分泌酶(γ-secretase)。 γ-secretase是涉及淀粉样-β肽裂解的四组分170 kDa的膜内蛋白酶。γ-secretase的功能障碍是促进早发性阿尔茨海默病(AD)患者大脑中淀粉样斑块形成的原因，因此科学家有兴趣将其作为潜在的药物靶标。γ-secretase也作为Notch信号传导的关键介质参与癌症。在分辨率为3.4 埃的γ-secretase的cryo-EM结构中发现，四跨膜束内核(core of a four-transmembrane bundle)的两个热点突变，削弱了蛋白酶活性，从而引起早发性阿尔茨海默病。这个原子模型可以帮助设计更具选择性的化合物。值得注意的是，γ-secretase糖基化对Cryo-EM数据集的结构重建几乎没有影响，而它却可能妨碍X-ray的结晶【10】。

　　离子通道。各种离子通道结构已经在不同的分辨率下得到了解决，包括几种潜在的药物靶标。 这些包括：瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员1(TRPV1)【11-13】和TRPA1【14】通道，它们分别参与传感和传导温度和刺激物;电压门控钙通道Ca v1.1【15】和钠通道NavPaS【16】，它们分别涉及骨骼肌组织的收缩以及可兴奋细胞中动作电位的产生和传播。被解析的通道蛋白还有很多，特别要指出的是，冷冻电镜最近对TRP家族中的通道蛋白研究产生了巨大的影响，在过去的4年中，约解析出了50个冷冻电镜结构。历史上，获得良好衍射的TRP通道晶体非常困难，因为它们在细胞中的基因表达水平低，并且对化学和物理刺激非常敏感。结合激动剂的TRPV1(2.9 埃)【13】，TRPML3(2.9 埃)【17】和TRPM4(2.9 埃)【18】结构是目前为止由Cryo-EM解析的膜蛋白的最高分辨率结构。同样重要的是，Cryo-EM在研究极大离子通道复合物也具有无可估量的价值，如Ryanodine受体(RyRs)【19, 20】，它们是已知最大的离子通道之一，质量为2.2 MDa，介导细胞内Ca2+释放并且是心脏疾病的新兴治疗靶点。这些解析出来的离子通道蛋白结构，将成为药物设计的重要靶点，同时也再次证明了Cryo-EM技术的强大。

　　ATP结合蛋白(ABC)转运蛋白。Cryo-EM也揭示了X-ray衍射难以处理的其他膜蛋白复合物的结构。例如解析并阐明真核ABC转运蛋白多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1, MRP1)识别底物以及底物结合如何刺激ATP水解的机制【21】。ABC转运蛋白在多种药物的吸收，分布，代谢和消除中发挥关键作用，可导致药物相互作用，因此，有关其结构的信息可能对药物开发同样具有重要价值。

　　5.2抗体和疫苗

　　要理解潜在生物治疗剂作用机制，必须通过表位作图分析阐明单克隆抗体(mAb)的活性。近年来，负染和cryo-EM已用于抗体的线性和构象表位作图。该方法仅需要微克量的抗体-抗原复合物，并且可以与其他表位定位技术结合使用，如氢-氘交换质谱(HDX-MS)或蛋白的快速光化学氧化(FPOP)技术。在最近的例子中，Long和他的同事使用cryo-EM阐明了病毒中和人mAb是如何结合病毒样颗粒，并阻断病毒和宿主膜融合的机制的【22】。Ciferri及其同事使用负染技术研究与HTRA1(一种与年龄相关的黄斑变性有关的丝氨酸蛋白酶)形成独特复合物并抑制其酶活性的抗体的结构【23】。该研究突出了IgG-HTRA1复合物的笼状结构，其较不紧凑的螺旋桨状排列，具有比Fab对应物更高的效力【23】。使用新的cryo-TEM技术可以进一步使表位作图更高效地辅助mAb设计。在抗体疫苗研究中使用cryo-EM的报道还有不少，该技术在研究动态目标中起着非常大的作用。

　　5.3潜在的先导化合物优化

　　目前药物研发人员非常感兴趣的一个问题是，Cryo-EM是否可用于药物设计的命中导向和前导优化阶段，这往往依赖于基于结构的药物设计(structure-based drug design，SBDD)。为了使SBDD在这些阶段发挥作用，在短时间内(与候选药物开发时间相比)快速而夯实地产生多种结构的流程是先决条件;而当目标可以结晶时，高通量X-ray晶体学一直是黄金标准——用一系列化合物与蛋白共结晶或浸泡法来产生共晶体，再通过同步辐射光源进行衍射数据收集，以高通量自动化方式进行分子置换和配体模型构建，产生多重化合物-靶标复合物的结构。为了有效利用结构信息进行药物设计，分辨率理想情况下应该小于2.5 埃。

　　尽管最近在 Cryo-EM方面解析的靶标复合物结构分辨率能够低于3 埃，但它还远没有X-ray高效。例如，一个限制是获得高分辨率Cryo-EM结构所需的时间框架仍然比X-ray晶体学慢几个数量级。尽管如此，一些例子说明了如果可以解决这些限制，Cryo-EM的潜力将是非常可喜的。Merk和他的同事确定了异柠檬酸脱氢酶(93 kDa)的3.8埃分辨率下的cryo-EM结构，并在结构上表征了小分子抑制剂结合引起的构象变化。Wong和他的同事确定了结合抗原生动物药物吐根碱【24】和甲氟喹【25】的恶性疟原虫80S核糖体的Cryo-EM结构，并且分辨率都达到了3.2 埃。

　　尽管在设计新的先导化合物中使用Cryo-EM的例子尚未见报道，但一些有希望的结果和正在进行的技术改进表明，Cryo-EM很快将被考虑作为SBDD的一个关键工具，特别是对难以结晶的目标，如膜蛋白。随着Cryo-EM产生的近原子分辨率结构的比例增加，相信制药行业的兴趣和期望也会越来越高。

　　5.4其他蛋白

　　除了膜蛋白之外，Cryo-EM在获得对神经退行性疾病靶标蛋白的结构理解方面也取得很多进展。最近的成功例子是，从阿尔茨海默病患者的脑中分离出了第一个高分辨率结构(3.4-3.5埃)的tau蛋白细丝【26】，其特征是成对螺旋丝(PHF)和直丝(SF)组成的神经原纤维tau聚集体。PHF和SF的Cryo-EM结构揭示了tau聚集体分子构象异构之间的差异，发现了异构体如何被掺入到长丝中。这些细丝的高分辨率结构测定开启了基于结构的药物发现的新的可能性，例如设计特定的抑制剂。

　　6 药物筛选中X-ray晶体学与Cryo-EM的比较

　　与Cryo-EM相比，X-ray晶体学在药物筛选方面的关键优势在于，能够快速提供高分辨率结构数据。一旦建立了合适的结晶系统，通过X-ray晶体学快速连续获得后续结构或筛选化合物所需的时间非常短：1小时内可以通过结晶自动工作站设置约2,000个结晶条件，2-3个小时即可评估所有图像以确定合适的结晶条件(可以通过图像识别软件来降低)。在同步加速器上采集一套完整的晶体数据不到2分钟，随后的数据整合、结构解析和蛋白质-配体复合物的精修已经很大程度上已经实现自动化，并且通常可以在1 小时内完成。然而，筛选以确定EM的合适样品和冷冻条件时，1次分析仅能评估12个样品，而为了充分表征它们又需要3-4个小时，与X-ray相比慢了好几个数量级。

　　重要的是，这意味着X-ray晶体学的通量对于药物配体筛选足够快。目前，用不同化合物浸泡的约500个晶体的数据可以在24小时内收集(例如，在英国Diamond synchrotron的XChem线站;上海SSRF的BL17U和BL19U1也有此潜力)，并且可以在在1周内在线处理和精修好(视结构解析者的数量和熟练程度)。 为了实现相同的目标，EM则需要大约半年的时间收集数据(假设每套数据8小时)，并且至少需要一年的计算和模型构建。即使有这些乐观的时间尺度假设，使用Cryo-EM的配体筛选过程也比使用X-ray晶体学的要慢2-3个数量级。

　　正如前文指出的那样，cryo-EM的一个关键优势是：它可以很容易地用于确定其天然状态下的大分子和/或动态大分子(包括膜蛋白)的结构，包括翻译后修饰。Cryo-EM对蛋白质的需求通常比X-ray晶体学更少，这对于要求苛刻的蛋白质可能是特别有利的。事实上，对于在药物研发中使用X-ray晶体学，获得合适的晶体仍然是一个关键挑战，有延迟项目的风险，特别是膜蛋白，重糖基化蛋白和大型或柔性蛋白或蛋白复合物，能否持续获得稳定、可靠、质量上乘的晶体存在很多不确定因素。为了应对这些挑战，人们已经开发了许多方法，例如将大的药物靶标减少到单个结构域，以期促进蛋白质生产，纯化和结晶。所以，在结构化指导的药物发现项目开始时，对时间和资源的投入往往是强制性的，以确保在筛选数百种化合物时具有足够的通量。

　　Cryo-EM的另一个重要优点是相位信息可以在重建结构和实验中直接获得，而相位信息在X-ray晶体学中丢失，必须通过实验进行相位重构，这取决于实验数据的准确性采集。因此，尤其是对于4-7.5 埃范围内的分辨率水平，通过Cryo-EM确定的结构，通常能够以无法通过X-ray晶体学获得的清晰度显现单个结构域和二级结构单元。但是，分辨率超过 3 埃时情况不同。只有一小部分已发表的Cryo-EM结构有超过3 埃的分辨率，并且在许多情况下，从Cryo-EM获得的3D图谱无法在质量上与通过X-ray晶体学获得的图谱在类似的分辨率下竞争。不过，在这一方面应该指出的是，X-ray晶体学和Cryo-EM的分辨率基于的方法差异很大，因此很多时候不能直接比较(见下一部分)。

　　7 X-ray晶体学和Cryo-EM的分辨率比较

　　在X-ray晶体学中，基于晶格的光子最大衍射、统计学、电子密度图谱与原子模型比较等标准直接度量分辨率【27】。在Cryo-EM中，傅里叶壳层相关函数(FSC)通常被用作主要的分辨率确定工具，用两个独立确定的三维图谱的一致性来衡量两个独立确定的三维图谱。分辨率由相关性下降到特定阈值(通常为0.143)以下的空间频率确定。FSC代表数据处理的自我一致性测量;因此，在Cryo-EM密度图中观察到的结构特征有时可能会偏离他们应该看到的分辨率期望。下图中显示了这一点，其中包含一系列Cryo-EM图，显示了在不同模拟和实际计算分辨率下可视化的芳香族和非芳香族残基(图5)。

　　图5. 芳香族和非芳香族残基的EM密度图

　　FSC是一种全局措施，因此仅提供一个平均分辨率值，考虑到大分子的结构柔性和典型的Cryo-EM辐射图中的非各向同性分辨率分布，这其实是误导性的。在最佳定义的密度图区域中，分辨率可能被低估;而所有Cryo-EM密度图的结构特征比FSC所指示的分辨率低得多。同样值得注意的是，FSC没有提供关于计算3D图谱给定质量的信息。

　　目前，有许多提交数据库的Cryo-EM结构报道有约3.5 埃的分辨率，与3.5 埃分辨率的X-ray晶体结构相比，它们的结构特征更为明确(在其结构明确的区域)。这部分是因为如上所述，FSC的全局分辨率低估了明确界定的特征分辨率。然而，这也是因为在分辨率>3.5 埃时，X-ray晶体学的结构解析在技术上是很困难的。其原因在于X-ray晶体学的观测参数比较差。因此，从采集的幅度数据进行相位重构效率低下，这反映在这些分辨率下的差的数据质量上。当晶体学数据处理变得越来越自动化和可靠时，这种情况在较高分辨率下会反转。相比之下，与3.5-4 埃分辨率范围内的结构相比，更高分辨率的结构测定(<3埃分辨率)在 Cryo-EM中困难得多。Cryo-EM结构测定中有几个参数可能会导致这种影响。例如，区分可能属于给定大分子复合物不同构象的粒子图像是非常困难的 --随着一个样品中存在不同状态的数量，这个问题变得越来越突出。诸如光束损伤和电子光学像差等其他效应也越来越限制高分辨率结构测定(<2.5埃)。当想确定<2 埃分辨率下的可靠结构时，轴向彗形像差将成为Cryo-EM中主要的分辨率限制像差。

　　8 Cryo-EM技术的未来展望

　　8.1目前Cryo-EM技术的瓶颈

　　处理较小的蛋白。 Cryo-EM一直被认为是只能适用于分子量大于500 kDa的生物大分子，然而，很多的药物靶点都是比这小的多的蛋白或者蛋白复合物。近年来技术的发展，理论上可以使Cryo-EM的样品小于65 kDa，实际上也确实在这方面有很多很大的突破。因此，越来越多的小于200 kDa的高分辨结构被解析出来。

　　样品制备的优化和数据分析。尽管Cryo-EM对样品的均一性没有X-ray那么高，但是样品的均一性还是保持样品完整度的重要保证。不均一的样品对后期数据处理非常艰难，而且也有可能使得数据的分辨率和结构信息的完整度下降。同样，EM Grid(格栅)的准备过程、数据采集和数据等过程的优化也可以提高Cryo-EM的分辨率。随着科学家的不懈努力，相信Cryo-EM技术会越来越强大，应用会越来越广泛。

　　8.2Cryo-EM技术的未来

　　在短短的几年内，令人振奋的Cryo-EM技术的进步推动了一个时代。今天，结构生物学家正在使用cryo-EM研究大型蛋白质复合物，大型细胞机器和病毒的结构和功能。技术的改进可能很快会产生更多小的膜蛋白结构。这些进步推动了人们的希望，未来的发展可能很快就会在“可以常规实现2 埃分辨率的黄金时代”即将来临时出现【4】，并且甚至提高了期待——Cryo-EM快速而有效的预期将与许多应用竞争，甚至取代晶体学【2, 3】。

　　事实上，对于制药行业的一些应用，Cryo-EM已经具有相当大的吸引力，因为它可能并不需要总是达到4 埃以下的分辨率;低分辨率结构对于更好地理解目标蛋白，以及位于蛋白质复合物的结构域或结合伴侣之间结合口袋的识别;药物设计时也可能不总是需要准确确定化合物的结合模式。此外，尽管Cryo-EM结构的分辨率通常受蛋白质动态变化导致的构象多样性限制，但由于重构各种中间状态有助于理解SBDD，所以该限制可转化为SBDD的优势，并解释一个复合体如何与其底物结合的机制。

　　为了利用这些机会，很多公司已经将更多的注意力集中在Cryo-EM上，使用各种方法来收集和处理EM数据，包括与学术实验室合作(通过合作或收费服务)。虽然即将推出的类似于同步加速器的设备承诺满足对Cryo-EM日益增长的需求，但存在诸多限制。在晶体学方面，晶体数据收集，结构解析与优化都非常迅速，使其成为需要多种结构小分子项目的极佳资源。在Cryo-EM中，每个数据采集跨越几个小时或几天的时间，使得cryo-EM的通量比晶体学小得多。但可以肯定的是，工业中使用Cryo-EM的速度正在迅速增加。因此，对于常规的药物研发来说，仍需要开发一些工具，才能使Cryo-EM成为药物猎手的首选方法----这需要投入强大的资金和耐心。

　　最后，在药物研发中使用Cryo-EM不仅取决于Cryo-EM技术的的发展，还可能取决于晶体学的进一步发展。在今天，可以看到完善的、自动化的、快速的、易于量化的晶体结构筛选体系，因为这个领域已经发展了几十年的时间。很难想象在接下来的几年或几十年中，Cryo-EM会发展成什么形式和速度，可以说，取代晶体学用于常规药物发现也不是没有可能。不过，可能更好的、更有可能的结果是：虽然选择二者的界限已经开始转向有利于Cryo-EM的方向，但似乎更有可能这两种技术仍将作为药物发现的方法、互相补充共同进步很长一段时间。

　　本文主要内容整理自参考文献【1, 5, 6】，可能存在个别专业词汇翻译不够准确的情况，敬请谅解!有兴趣的读者请查看原文。

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