局灶节段性肾小球硬化的基因诊断策略

局灶节段性肾小球硬化(FSGS)是一种基于形态学的病理诊断，其关键病理生理基础是足细胞损伤。FSGS常见于肾小球肾炎，其发病率具有明显的年龄、人种和地域的差异。我国FSGS约占总活检病例的3.3%～16%。FSGS约占白人儿童肾病综合征的20%，成人肾病综合征的40%。FSGS预后较差，是成人及儿童激素抵抗型肾病综合征(SRNS)和终末期肾病(ESRD)最常见的原因之一，50%持续性蛋白尿不缓解的FSGS肾病综合征患者5-10年内将进展为ESRD。

遗传性FSGS发病机制

FSGS为一病理诊断，其病理特征为肾小球瘢痕，电镜下可见典型足细胞损害。除了原发性FSGS，10%左右FSGS具有家族聚集性(遗传性FSGS)，此外FSGS还可继发于病毒、药物、肾组织减少、缺血缺氧等。原发性FSGS病因不明，研究相继报道了suPAR、CLC-1、microRNAs等循环渗透性因子与蛋白尿相关，但其机制仍不明确。人类基因组计划(HAPMAP)和新一代测序技术极大推动遗传性FSGS致病基因的克隆定位，现已报道引起FSGS单基因突变，包括：转录因子、裂孔膜结构蛋白、信号通路相关蛋白、细胞骨架蛋白、细胞/细胞外基质、溶酶体相关蛋白、线粒体功能相关蛋白等。nephrin(NPHS1)、podocin(NPHS2)和CD2相关蛋白(CD2AP)为裂孔膜的重要组成蛋白，足细胞转录因子包括WT1、PAX2、LMX1B调节足细胞早期发育和分化，这些基因突变均可导致FSGS发生。TRPC6为足细胞膜表面的钙离子内流通道，突变后可导致钙离子内流增加引起发病。PLCE1属于磷脂酶C家族，调控肾小球发育，其突变可引起FSGS和弥漫性系膜硬化(DMS)。此外，ACTN4、MYH9等足细胞骨架相关分子突变也可与FSGS密切相关。

哪些FSGS患者需要进行基因诊断？

具有家族史的FSGS患者

家族性FSGS主要表现为常染色体显性或隐性遗传模式。家族性FSGS多数对激素和免疫抑制治疗反应差，相对无家族史患者临床及病理表现较重，预后较差，易进展为ESRD。可能与两者发病机制不同有关。FSGS在家族中聚集提示遗传机制在发病中起重要作用，目前已确定多种足细胞相关基因突变可导致家族性FSGS，其中在成年白人诊断为家族性FSGS患者中最常见的致病基因包括INF2(13%-17%)和COL4As(10%-12%)，在汉族人中目前报道COL4A3最为常见(12.5%)，但仍有超过50%的家族性FSGS不能以已知基因突变解释，提示未知致病基因亟待发现。

早发儿童肾病综合征患儿

在儿童中，大部分肾病综合征患儿并不像成人常规行肾活检，故儿童中FSGS的发病率常常被低估。越来越多的研究表明，在原发性肾病综合征中，微小病变肾病和FSGS在临床表现、治疗反应和预后中相似，FSGS更倾向于为微小病变肾病患者足细胞进一步损伤的结果。而人类遗传学研究和动物模型研究显示，DMS和FSGS也同样具有相似的发病机制，“严重”突变如蛋白截短突变会导致DMS—肾小球进展性病变，表现为肾脏发育不良，而相同基因的"轻度"突变如错义突变，则导致退化性的肾小球改变FSGS。在儿童FSGS病因学研究中，肾病综合征的患者虽病理类型不一却可进行整体探索。

激素抵抗型肾病综合征患者

不同于儿童肾病综合征和家族性FSGS患者，成年散发性FSGS因其发病的影响因素较多，基因检测阳性率较低，其中与遗传相关的患者，疾病严重程度更高，对激素治疗反应差及快速进展至ESRD。研究证实，25岁前起病的SRNS已知致病基因筛查检出率高达29.5%，且与疾病的发病年龄呈明显负相关，新生儿患儿(<3个月)中明确致病基因的占69.4%，4-12个月的患儿致病基因检出率为49.7%，而只有12%的13-18岁青年检测出致病基因突变。对SRNS患者早期进行基因检测可有效避免不必要的激素和免疫抑制剂的大量使用。

具有特异性临床综合征

在临床上根据有无其他系统受累，可将FSGS分为非系统性(孤立性)和系统性，前者是指疾病仅累及肾脏，而后者还可同时伴有多系统受累。WT1表现尤为显著，KTS结构域的突变导致Frasier综合征，而其他错意突变可导致Denys-Drash综合征或原发性肾病综合征。对特定临床表型SRNS患者进行基因筛查很关键，如WT1突变有患性腺胚细胞瘤的风险。其他基因突变相关的系统性FSGS的临床特征（见下表）。

FSGS为局灶节段性肾小球硬化；SRNS为激素抵抗型肾病综合征

怎样进行基因诊断？

家系调查

应重视对FSGS患者询问肾脏病家族史，对有家族史的FSGS患者开展家系调查。除先证者外，应调查其他家庭成员的临床资料，包括起病年龄、起病症状、肾外改变和实验室检查(肾功能、尿常规、尿微量白蛋白等)等，调查世代不应少于3代，家系调查有助于判断家族性FSGS的遗传模式。肾组织病理检查特别是电镜检查、肾组织及皮肤Ⅳ胶原不同α链染色、α半乳糖苷酶A活性等特殊检查有助于与其他遗传性肾脏疾病相鉴别。虽然部分患者否认家族史，由于FSGS起病时往往较为隐匿且发病与年龄有关，对高危家族成员进行随访仍可能发现疑似患者。成人家族性FSGS多为常染色体显性遗传，该情况下，除外体细胞突变和不完全外显基因突变，先证者的父母一方多为患者，且呈世代遗传的模式，家庭中男女发病率相同。常染色体隐性遗传多见儿童，疾病呈隔代遗传模式，先证者父母双方通常为临床表现正常或轻微的杂合突变携带者，且常有近亲婚配史。尽管FSGS中鲜有报道，如果致病基因位于X染色体则表现为伴性遗传(XD/XR)，可存在明显的性别临床表型差异和交叉遗传。

家族性FSGS诊断标准：家系成员至少有一名经肾活检证实为FSGS，并符合下述条件中任意一条：(1)家系另一成员也经肾活检确诊为FSGS；(2)家系其他成员有不明原因大量蛋白尿或肾衰竭。排除标准：Alport综合征、Fabry病等其他遗传性肾脏疾病及继发性FSGS。

检测基因选择

通过家系调查判断遗传模式以及患者的起病年龄有助于候选基因选择。遗传性FSGS致病基因中呈常染色体隐性遗传的基因包括NPHS1、LAMB2或PLCE1等，这些基因突变患者常于儿童早年发病。常染色体显性遗传的基因包括COL4A3/A4、WT1、ACTN4、TRPC6、INF2、ANLN和ARHGAP24等，多表现为成年发病。相同基因的不同基因位点突变也可以表现为不同发病年龄，如携带NPHS2基因R138Q突变可导致幼年发病，而R229Q的复合杂合突变则表现为成年发病的SRNS。除此以外，临床同样表现为先天性肾病综合征的DMS患者常可检测到LAMB2、WT1、NPHS1或PLCE1突变。

国际大型多中心研究显示，先天型(3个月内起病)和婴儿型(3个月至1岁起病)SRNS中检出率最高的前五位基因依次为NPHS1、NPHS2、WT1、LAMB2、PLCE1。儿童型SRNS(1-12岁起病)中，NPHS2、WT1、SMARCAL1检出率最高。汉族儿童散发肾病综合征研究显示，NPHS1、NPHS2和WT1基因突变频率在5岁内起病的SRNS中较高，推荐这些人群中优先选择这3个基因作为目标基因进行筛查。

基因检测方法选择

以往诊断单基因突变SRNS主要通过基于外周血基因组DNA的传统PCR扩增及直接测序技术—Sanger测序，其操作方法简便，被用作标准的鉴定方法以及最终确定突变的确切位点和突变性质的手段。但由于一代测序的通量小，只能进行单个DNA片段的分析，其应用前景受限。随着高通量测序技术的不断进展和费用的不断降低，使得突变分析时间和成本大幅下降。基因panel测序技术是基于某种临床表型所进行的已知候选基因的突变筛查技术，主要采用二代测序方法，针对性强且节约成本，经济高效的特点使其成为目前基因诊断的首选。二代测序技术还包括全外显子测序(WES)和全基因组测序(WGS)，是利用序列捕获技术将基因组的DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法，由于获得全外显子组或全基因组海量数据的临床解读较为困难，对数据分析要求及成本较高，目前主要用于科研。可以预见随着WES/WGS分析方法的改进以及成本进一步降低，WES/WGS有望在不远的将来应用于临床，可推进临床诊治水平(见下表)。

基因诊断解读：临床诊治、遗传咨询和产前诊断

临床诊治

2016年，Münch1等在未行肾活检的前提下成功通过基因检测诊断一例INF2突变患者，打破了基于肾脏病理的常规诊断体系。此外，研究致病基因为一些少见的单基因突变提供潜在的治疗靶点，如COQ2、COQ6、ADCK4或PDSS2调节CoQ10生物合成，而携带这些特定突变的患者可以通过补充辅酶Q10而临床获益[5,6,7]。此外，携带PLCE1突变隐性遗传的FSGS患者使用环孢素A治疗能完全缓解[28]，CUBN突变FSGS患者可以进行维生素B12的治疗，理论上ARHGDIA突变的FSGS患者依普利酮治疗后能缓解[29]。WT1的KTS结构域突变特定核型有患性腺胚细胞瘤的风险[13]。携带TRCP6突变可能对钙调神经酶抑制剂治疗反应较好。一项队列研究发现，儿童SRNS中，携带基因突变的患儿肾移植复发率为4.5%，而在无遗传背景的患儿中高达25.8%[8]，对已进展至ESRD的FSGS患者及供肾者进行基因诊断仍可避免不必要的移植后复发，在计划进行活体肾移植时，应排除尚未发病的供肾亲属存在致病突变。

遗传咨询和产前诊断

遗传咨询和产前诊断在遗传病的诊疗中起到不可或缺的作用，是理解遗传病发生和预防再发的重要手段。在明确致病基因及其遗传方式的前提下，可评估先证者同胞或子代的再发风险。除常规风险分析外，还应注意不同突变的各自特点，已知NPHS2突变的患者其无症状配偶应行NPHS2基因p.R229Q分析，如携带该位点突变，其子女发生FSGS的危险性高达50%。WT1突变所致DMS/FSGS女性(46，XX)患者，子女发病风险为50%，表型取决于核型，如核型为46XY表现为Denys－Drash综合征或Frasier综合征，如核型为46XX将不会出现两性畸形。对高危胎儿可进行产前诊断，包括胎儿染色体和基因分析的常见技术——羊膜腔穿刺、绒毛活检、脐静脉穿刺。依据诊断结果，即胎儿的基因型和可能的临床结局进行优生优育。2016年，国内通过使用第三代试管婴儿技术(胚胎植入前遗传学诊断技术)首次成功阻断显性多囊肾遗传基因，意味着有家族史的单基因遗传性FSGS也有望通过基因诊断阻断其向下一代传递。

越来越多证据显示，基因诊断对遗传性FSGS的诊断与治疗有重要意义，有助于患者家人早期诊断和早期干预，为个体化精准医疗提供依据，随着测序成本不断下降，可考虑对家族性、儿童、SRNS和具有临床综合征的FSGS患者进行基因检测，基于二代测序技术的基因panel测序具有针对性强和性价比高的优势，可作为目前FSGS基因诊断首选方法。随着对FSGS遗传机制理解的不断深入，基因诊断必将大幅提高临床实践，让更多患者受益。

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