献给初学者：如何在细胞中稳定表达基因

作为细胞生物学专业的博士生，在基因功能研究上已经有五年的经验了，今天我给大家讲讲其中经常用到并且非常重要的一种技术--慢病毒包装的过表达体系。下面我就从引物设计，慢病毒表达质粒构建等方面详细讲述。

下面以 plex-MCS 载体为例。

1. 选择酶切位点，为了避免移码突变，上游的酶切位点选择起始密码子 ATG 前面的 spel，下游选择 xho1。

2. 构建方法的选择。

连接法

对于连接法，首先设计引物将目的基因 PCR 出来，即酶切位点加基因引物，此时应注意，为了防止酶切将基因破坏，通常习惯在两端加入保护碱基。

保护碱基的查找见 http://blog.sina.com.cn/s/blog_7188922f0100xa75.html。尽量选择分数较高的保护碱基。

以 PKM2 基因为例，设计引物，首先查找它的序列，进入 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

选择目的基因的种属来源。

选择目的基因的亚型。

查找到目的基因的 CDS 序列，以 FASTA 格式导出。

那么 PKM2 上下游引物分别为：

设计好引物后，通过 PCR 方法扩增目的基因，随后胶回收，同样使用 spe1 和 xho1 进行双酶切，回收后产物与载体酶切回收产物连接即可。

重组法

对于重组法，首先设计引物将目的基因 PCR 出来，即同源臂加基因引物，此时应注意，同源臂应包含酶切位点，同样以 PKM2 基因为例。其上下游引物分别为：

设计好引物后，通过 PCR 方法扩增目的基因，胶回收后的产物与载体酶切回收产物重组即可。

3. 转化，涂板，挑单克隆，测序。

4. 质粒构建成功后即可转染观察是否能在细胞中表达。

以上就是通过慢病毒包装体系在细胞中过表达基因的方法，此外还应注意几点：

1. 在构建质粒时，最好可以加入 GFP 标签，这样可以通过荧光的方法观察基因的表达情况，同时也有利于稳定筛选。

如果过表达效率不高时，可以通过流式细胞术进行筛选，获得带 GFP 的阳性细胞，使之纯度变高。

2. 在传代的过程中，由于细胞不断分裂，过表达的效果会不断减弱，所以如果需要更高纯度的阳性细胞，需要挑单细胞.

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