微生物学和寄生虫学讨论

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【讨论】HBV分子病毒学研究中常用的几种肝细胞（系）

楼主收藏举报帖子创建时间: 2013-01-18 07:43 回复：19 关注量：296

1. HepG2
最经典的肝癌细胞系之一，大约30多年前分离自一位15岁美国白人男孩的肝癌组织，形态为上皮细胞，极性细胞；乙肝表面抗原阴性，对G418有抗性。由ATCC收录（www.atcc.org/SearchCatalogs/linkin/?id=HB-8065）。
主要特点是可以大规模培养，对除Viral Entry step之外的HBV lifecycle支持度好，是研究HBV基因表达/病毒复制的重要模型。缺点是培养时容易成团叠层成菌落状，最好先用collagen处理培养瓶/皿。

2. HuH-7
1982年（也是大约30年前）分离自一位57岁日本男性的肝癌组织。上皮样细胞，但为非极性细胞（2D培养下），乙肝表面抗原阴性。由JCRB Cell Bank收录（http://cellbank.nibio.go.jp/legacy/celldata/jcrb0403.htm）。
优点类似HepG2细胞，相比更易于培养，且转染效率更高，瞬时转染HBV表达质粒后上清中可收获10^6-10^7 copies/ml的病毒颗粒。缺点是该细胞未被ATCC收录，市面上存在不少亚克隆，来源不单一，导致不同实验室的来源不同的HuH-7细胞株上的结果很可能无法直接比较。

BTW，很有意思的一个现象是，尽管HepG2和HuH-7细胞对干扰素处理后的应答通路表现良好，下游的ISG比如MxA/OAS/PKR等等都能检测到显著的上调，但是转染后HBV在细胞中的复制对干扰素不敏感，原因目前还不十分清楚。

（待续）

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阳光海岛 2013-03-20 12:47
#1

再来帮楼主增加一条比较新的吧，是人源化的小鼠模型。
美国的一家公司的科学家研发的一种基因改造过的（FRG KO）小鼠，能够扩增人的肝细胞，并逐步替换掉自身的鼠肝细胞。
对于数量比少价格贵的原代肝细胞，这将成为一个非常好的扩增手段，从而获得更多的原代肝细胞进行体外实验。
另外，当小鼠的肝脏被人源化之后，也可以作为新的一种小鼠模型（人肝），进行体内药物实验，特别是进行ADMET相关实验，以及HBV感染模型。
blowapc 2013-01-18 15:01
#2

谢谢楼主发起讨论，置顶~~~欢迎各位战友参与！
starrweb 2013-01-18 21:41
#3

3. HepG2 2.2.15
1987年由西奈山医学院的研究人员构建（作者之一是中国人Mei-Ling CHEN）。通过转染将两对“头尾相接”的HBV基因组dimer整合入HepG2细胞基因组。该细胞系在分化培养条件下可以产生高滴度的HBV感染性颗粒（~10^8 copies/ml）,同时核内可检测到cccDNA的存在（尽管含量很低），一直是抗HBV药物筛选的重要细胞模型。缺点是该细胞系太过古老且缺乏原始种子库，导致在连续培养快三十年后，其细胞生物学特性和祖细胞HepG2差异很大，缺乏合适的对照，无法作为功能基因研究的合适模型了。

考虑到这一问题，美国和德国的相关研究人员基于HepG2又各自建立了另外两种新细胞系：

HepAD38 和 HepG2 H1.3
前者包含1.1拷贝的整合HBV基因组，其表达由诱导型CMV-tet启动子调控，病毒产量甚至高于HepG2 2.2.15，分化培养所需时间也较短。
后者包含1.3拷贝的整合HBV基因组，使用HBV自身的启动子，相对比较接近体外感染过程中/后的HBV-Cell Interaction，适合用于HBV相关功能基因（组）的研究。
starrweb 2013-01-18 23:08
#4

4. PHH （primary human hepatocytes）
人原代肝细胞体外分离培养技术，由德国科学家于2003年建立（http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016882780300120X）。作为原代细胞，自然有着任何肿瘤细胞系所无法匹敌的优点，能够被HBV直接感染，接近自然感染过程中生理学生物学指标，是目前最为可靠的体外感染模型。利用灌流技术从手术切除的患者正常肝组织中分离PHH，目前技术上已经相当成熟，但操作上仍比较复杂，对肝源质量和培养条件要求苛刻，细胞本身无法传代，生命周期有限，尤其考虑其细胞来源的特殊性，显然是无法规模化推广的，仅限于少数实验室的“奢侈品”。

树鼩是目前已知的除人类和黑猩猩之外唯一可被HBV感染的动物模型。近期中国的科研团队也已经利用分离培养的原代树鼩肝细胞成功鉴定出HBV的功能性受体NTCP。如果能够解决树鼩的大规模人工繁殖问题，相信PTH将会是非常好的替代PHH的重要工具。
starrweb 2013-01-19 00:41
#5

5. HepaRG
由法国科学家于2002年建立，是一种具有定向分化潜力的肝脏祖细胞，在体外分化培养条件下可以定向分化为具有肝细胞和胆管细胞功能及特征的细胞。分化后的HepaRG细胞在形态和功能上和PHH非常接近，是目前唯一可以被HBV体外感染的非肿瘤细胞系，具备包含Viral entry step在内的完整HBV lifecycle，应该说是HBV病毒学研究及新药筛选的最佳工具。HepaRG细胞目前已经被一家法国公司BIOPREDIC商业化了，国内的研究者可以通过Invitrogen或Minipore公司购买分化后的细胞，当然，价格不菲。
HepaRG细胞的主要缺点是，对培养条件要求非常严格，且细胞需要连续培养并分化大约4周，之后如果一切无误方能用于HBV感染实验。此外，即便是有经验的研究人员提供了最理想的培养条件，HBV在HepaRG上的感染效率也只有大约10-15%（即便是PHH也同样如此），复制水平远没有基于质粒转染来的高，这也正是目前体外感染实验的瓶颈所在。另有研究表明，HepaRG感染HBV之后的cccDNA水平较低，未能检测到显著的rcDNA-cccDNA recycling，其原因还有待进一步的探索。
starrweb 2013-01-19 01:25
#6

最后来说说几种我不太熟悉或正在建立之中的细胞系

6. L02
非肿瘤的正常人肝细胞株（也有资料说是人胚胎肝细胞株，不能确定）。很可惜从来没有用过这个细胞株，也未能查到该细胞具体的来源信息，希望有知情的朋友可以帮忙补充。目前国外使用L02细胞用于HBV相关研究的报道还不多见，主要还是来自国内的研究团队。作为一种区别于HepG2/HuH-7等肿瘤细胞的正常肝细胞株，在某些特定的研究背景下，L02会有其独特的优势。如何被国际同行所认可，可能是该细胞被广泛运用的前提。

7. HepG2-NTCP / HuH7-NTCP
去年底，由北京生命科学研究所李文辉博士所领导的研究小组成功鉴定出了HBV功能性受体NTCP。这可被视为HBV研究领域近十年来最重要的进展之一。此项研究的核心成果及应用之一，就是过表达NTCP的HepG2/HuH7细胞，可以成功被HBV感染（效率类似PHH/HepRG细胞）！简单方便，任何实验室都可以很容易的重复，相信类似的细胞系会得到非常广泛的运用。
heroxiao 2013-03-01 17:27
#7

楼主总结得非常好，学习了！
kekeqian1013 2013-03-04 23:46
#8

整理的相当好，辛苦了
laforet 2013-03-07 04:59
#9

我要请教一下HepG2究竟对G418有没有抗性？ATCC的资料里没有提及，大部分卖G418的网站上反而有这一条，引用的文献都找不到全文。反而是HepG2转染后用G418筛选的文章有很多。
阳光海岛 2013-03-20 12:47
#10

再来帮楼主增加一条比较新的吧，是人源化的小鼠模型。
美国的一家公司的科学家研发的一种基因改造过的（FRG KO）小鼠，能够扩增人的肝细胞，并逐步替换掉自身的鼠肝细胞。
对于数量比少价格贵的原代肝细胞，这将成为一个非常好的扩增手段，从而获得更多的原代肝细胞进行体外实验。
另外，当小鼠的肝脏被人源化之后，也可以作为新的一种小鼠模型（人肝），进行体内药物实验，特别是进行ADMET相关实验，以及HBV感染模型。

阳光海岛帖子创建时间: 2013-03-20 12:47

再来帮楼主增加一条比较新的吧，是人源化的小鼠模型。
美国的一家公司的科学家研发的一种基因改造过的（FRG KO）小鼠，能够扩增人的肝细胞，并逐步替换掉自身的鼠肝细胞。
对于数量比少价格贵的原代肝细胞，这将成为一个非常好的扩增手段，从而获得更多的原代肝细胞进行体外实验。
另外，当小鼠的肝脏被人源化之后，也可以作为新的一种小鼠模型（人肝），进行体内药物实验，特别是进行ADMET相关实验，以及HBV感染模型。

blowapc 帖子创建时间: 2013-01-18 15:01

谢谢楼主发起讨论，置顶~~~欢迎各位战友参与！

starrweb 帖子创建时间: 2013-01-18 21:41

3. HepG2 2.2.15
1987年由西奈山医学院的研究人员构建（作者之一是中国人Mei-Ling CHEN）。通过转染将两对“头尾相接”的HBV基因组dimer整合入HepG2细胞基因组。该细胞系在分化培养条件下可以产生高滴度的HBV感染性颗粒（~10^8 copies/ml）,同时核内可检测到cccDNA的存在（尽管含量很低），一直是抗HBV药物筛选的重要细胞模型。缺点是该细胞系太过古老且缺乏原始种子库，导致在连续培养快三十年后，其细胞生物学特性和祖细胞HepG2差异很大，缺乏合适的对照，无法作为功能基因研究的合适模型了。

考虑到这一问题，美国和德国的相关研究人员基于HepG2又各自建立了另外两种新细胞系：

HepAD38 和 HepG2 H1.3
前者包含1.1拷贝的整合HBV基因组，其表达由诱导型CMV-tet启动子调控，病毒产量甚至高于HepG2 2.2.15，分化培养所需时间也较短。
后者包含1.3拷贝的整合HBV基因组，使用HBV自身的启动子，相对比较接近体外感染过程中/后的HBV-Cell Interaction，适合用于HBV相关功能基因（组）的研究。

starrweb 帖子创建时间: 2013-01-18 23:08

4. PHH （primary human hepatocytes）
人原代肝细胞体外分离培养技术，由德国科学家于2003年建立（http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016882780300120X）。作为原代细胞，自然有着任何肿瘤细胞系所无法匹敌的优点，能够被HBV直接感染，接近自然感染过程中生理学生物学指标，是目前最为可靠的体外感染模型。利用灌流技术从手术切除的患者正常肝组织中分离PHH，目前技术上已经相当成熟，但操作上仍比较复杂，对肝源质量和培养条件要求苛刻，细胞本身无法传代，生命周期有限，尤其考虑其细胞来源的特殊性，显然是无法规模化推广的，仅限于少数实验室的“奢侈品”。

树鼩是目前已知的除人类和黑猩猩之外唯一可被HBV感染的动物模型。近期中国的科研团队也已经利用分离培养的原代树鼩肝细胞成功鉴定出HBV的功能性受体NTCP。如果能够解决树鼩的大规模人工繁殖问题，相信PTH将会是非常好的替代PHH的重要工具。

starrweb 帖子创建时间: 2013-01-19 00:41

5. HepaRG
由法国科学家于2002年建立，是一种具有定向分化潜力的肝脏祖细胞，在体外分化培养条件下可以定向分化为具有肝细胞和胆管细胞功能及特征的细胞。分化后的HepaRG细胞在形态和功能上和PHH非常接近，是目前唯一可以被HBV体外感染的非肿瘤细胞系，具备包含Viral entry step在内的完整HBV lifecycle，应该说是HBV病毒学研究及新药筛选的最佳工具。HepaRG细胞目前已经被一家法国公司BIOPREDIC商业化了，国内的研究者可以通过Invitrogen或Minipore公司购买分化后的细胞，当然，价格不菲。
HepaRG细胞的主要缺点是，对培养条件要求非常严格，且细胞需要连续培养并分化大约4周，之后如果一切无误方能用于HBV感染实验。此外，即便是有经验的研究人员提供了最理想的培养条件，HBV在HepaRG上的感染效率也只有大约10-15%（即便是PHH也同样如此），复制水平远没有基于质粒转染来的高，这也正是目前体外感染实验的瓶颈所在。另有研究表明，HepaRG感染HBV之后的cccDNA水平较低，未能检测到显著的rcDNA-cccDNA recycling，其原因还有待进一步的探索。

starrweb 帖子创建时间: 2013-01-19 01:25

最后来说说几种我不太熟悉或正在建立之中的细胞系

6. L02
非肿瘤的正常人肝细胞株（也有资料说是人胚胎肝细胞株，不能确定）。很可惜从来没有用过这个细胞株，也未能查到该细胞具体的来源信息，希望有知情的朋友可以帮忙补充。目前国外使用L02细胞用于HBV相关研究的报道还不多见，主要还是来自国内的研究团队。作为一种区别于HepG2/HuH-7等肿瘤细胞的正常肝细胞株，在某些特定的研究背景下，L02会有其独特的优势。如何被国际同行所认可，可能是该细胞被广泛运用的前提。

7. HepG2-NTCP / HuH7-NTCP
去年底，由北京生命科学研究所李文辉博士所领导的研究小组成功鉴定出了HBV功能性受体NTCP。这可被视为HBV研究领域近十年来最重要的进展之一。此项研究的核心成果及应用之一，就是过表达NTCP的HepG2/HuH7细胞，可以成功被HBV感染（效率类似PHH/HepRG细胞）！简单方便，任何实验室都可以很容易的重复，相信类似的细胞系会得到非常广泛的运用。