老板让我做质粒接合试验，因为以前没有做过，实验室内也没有可以参考的，都是自己摸索，期间经历了一些曲折，现在成功做出来了，想在这儿分享以下自己的一些相关经验。不足之处请各位站友不吝斧正。

       我做的是CRE的质粒接合试验，一开始我们把需要买的东西列了个清单，发现很多东西都没有，比如说亚胺培南地标准品，J53大肠杆菌，最后这两样关键的东西花了三个多月才买到，尤其是J53，这东西货期特别长，得从美国ATCC生物库订购。剩下的叠氮钠是借用隔壁实验室的。其他的诸如MH琼脂粉，等都用的是现成的。

      备齐东西以后，开始对J53、CRE进行复苏，然后我的最曲折的经历里头就是配制用以筛选接合菌的筛选平板，在这儿我吃了不少的亏，当时查了好几篇文献（偷懒查的都是中文文献，悲剧始于此），当时看好几篇文献，当中还有微生物领域某大牛的博士毕业论文，大家都写了配制MH筛选平板的亚胺培南浓度0.2mg/L或者0.25ug/ml之类之类的，看到这，我当时是有一丝疑惑的，明显低于敏感的MIC，能筛选出耐药菌？但是还是照着做了，果不其然，第二天平板上密密麻麻的都是细菌，筛选失败。后来我的筛选平板上改成了2mg/L亚胺培南和180mg/L的叠氮钠的MH平板，筛选顺利成功，药敏结果符合预期，这个摸索筛选平板的时候总共花了将近两个星期。然而，等到我过了两天再次用先前配制的平板进行另一株菌的接合菌筛选时却失败了，后来我拿了J53和CRE分别涂布在同一批的另一个平板上的时候，发现J53长的很好，CRE不长了。表明亚胺培南失效了，考虑亚胺培南水溶液不稳定，筛选平板最好现配现用。后来重新制作了一次平板又成功了，以后再也没有出现过这个问题，目前NDM和KPC均能顺利转移到接合菌上，其他碳青霉烯酶基因尚未尝试。

      最后贴出我的试验详细过程，希望同道们能够少走弯路，也希望有同道能够对我实验中的不足提出批评。

      1. J53和CRE均用普通琼脂平板复苏过夜（J53明显长的比较慢，两个都在普通温箱养足24小时没关系）；

      2. 在平板上分别刮取单个菌落使用无菌肉汤增菌（5ml），18小时；

      3. J53和CRE按照5：1比例混合好来，吸取150ul滴加到贴了0.22的滤膜的血平板（贪图方便直接拿过来就用了）过夜培养；

      4. 揭下长菌的滤膜，用一个广扣的无菌容器装好，倒入5毫升肉汤涮洗，稀释100倍后，吸取150ul滴在筛选平板上，均匀涂布，过夜培养，挑取单个菌落进行药敏，耐药基因扩增等实验进行验证。

       老板让我做质粒接合试验，因为以前没有做过，实验室内也没有可以参考的，都是自己摸索，期间经历了一些曲折，现在成功做出来了，想在这儿分享以下自己的一些相关经验。不足之处请各位站友不吝斧正。

       我做的是CRE的质粒接合试验，一开始我们把需要买的东西列了个清单，发现很多东西都没有，比如说亚胺培南地标准品，J53大肠杆菌，最后这两样关键的东西花了三个多月才买到，尤其是J53，这东西货期特别长，得从美国ATCC生物库订购。剩下的叠氮钠是借用隔壁实验室的。其他的诸如MH琼脂粉，等都用的是现成的。

      备齐东西以后，开始对J53、CRE进行复苏，然后我的最曲折的经历里头就是配制用以筛选接合菌的筛选平板，在这儿我吃了不少的亏，当时查了好几篇文献（偷懒查的都是中文文献，悲剧始于此），当时看好几篇文献，当中还有微生物领域某大牛的博士毕业论文，大家都写了配制MH筛选平板的亚胺培南浓度0.2mg/L或者0.25ug/ml之类之类的，看到这，我当时是有一丝疑惑的，明显低于敏感的MIC，能筛选出耐药菌？但是还是照着做了，果不其然，第二天平板上密密麻麻的都是细菌，筛选失败。后来我的筛选平板上改成了2mg/L亚胺培南和180mg/L的叠氮钠的MH平板，筛选顺利成功，药敏结果符合预期，这个摸索筛选平板的时候总共花了将近两个星期。然而，等到我过了两天再次用先前配制的平板进行另一株菌的接合菌筛选时却失败了，后来我拿了J53和CRE分别涂布在同一批的另一个平板上的时候，发现J53长的很好，CRE不长了。表明亚胺培南失效了，考虑亚胺培南水溶液不稳定，筛选平板最好现配现用。后来重新制作了一次平板又成功了，以后再也没有出现过这个问题，目前NDM和KPC均能顺利转移到接合菌上，其他碳青霉烯酶基因尚未尝试。

      最后贴出我的试验详细过程，希望同道们能够少走弯路，也希望有同道能够对我实验中的不足提出批评。

      1. J53和CRE均用普通琼脂平板复苏过夜（J53明显长的比较慢，两个都在普通温箱养足24小时没关系）；

      2. 在平板上分别刮取单个菌落使用无菌肉汤增菌（5ml），18小时；

      3. J53和CRE按照5：1比例混合好来，吸取150ul滴加到贴了0.22的滤膜的血平板（贪图方便直接拿过来就用了）过夜培养；

      4. 揭下长菌的滤膜，用一个广扣的无菌容器装好，倒入5毫升肉汤涮洗，稀释100倍后，吸取150ul滴在筛选平板上，均匀涂布，过夜培养，挑取单个菌落进行药敏，耐药基因扩增等实验进行验证。

这只能说是你自己个人的经验。

关于筛选平板的亚胺培南浓度，2mg/L亚胺培南肯定是太高了，你能接过去说明你的碳青霉烯酶的耐药水平比较高，能够在2mg/L的平板上生长那么它的MIC就是4mg/L了，敏感株的MIC一般都<0,125mg/L，不可能在0.25-0.5mg/L的平板上生长，KPC有时可以达到这个水平（根据我多年的经验，含KPC的接合子亚胺培南的MIC一般为2-4mg/L，少数为1mg/L或8mg/L，甚至16mg/L），很多金属酶的碳青霉烯MIC是很低的（MIC也就0.25-0.5mg/L），用2mg/L亚胺培南是接不过去的，除非你的亚胺培南失效或部分失效导致浓度下降了。我一般用的是利福平耐药的EC600，在0.25mg/L的亚胺培南平板上是不会生长的。另外，正如你所说亚胺培南易失效，所以我们一般用美罗培南。如果你在医院工作，药房里的泰能（亚胺培南+西司他丁为1:1）就很好用了。随便怀疑别人的实验方法和结果是不太好的，大家都这样做出来你做不出来可能就是你自己的问题了。另外J53国内有很多实验室都有的，不必大费周章去美国买。

关于接合试验的操作过程，其实没有固定标准。

菌株的复苏就看习惯了，肠杆菌科细菌我们一般用弱筛选平板如中国蓝或者麦康凯，血平板也可以，当然普通琼脂平板也行，只要能生长。

受体菌和受体菌刮取单个菌落是有风险的，特别对于供体菌，因为耐药基因位于质粒上，那么就存在质粒丢失的风险，你可能没碰到过，做的多了就难说了。

接合前的细菌一般采用对数生长期较好，你摇18小时也能做出来说明这样也是可以的，我是没试过。KPC还是比较容易接的，NDM那就太容易，受体菌和受体菌混合几分钟就接过去了。

EC600菌株，好多实验室都有的，你可以通过文献找到这些人的联系方式，然后通过邮件向他们索取，当然了，如果你老板肯出面就更好了！我当时的是从华山医院王明贵老师那里要的，不过现在已经毕业了，要不我就给你邮寄一株了！

最好祝楼主好运！

首先给楼主点个赞！我喜欢你这样的学生！

正如江南版主所言，我们做实验时不能轻易否定别人的方法。为什么需要有预实验？就是让大家试试文献提供的参考条件、或者本实验室以前建立的方法。别人能做出来，并不能代表你能做出来。不同实验室、不同仪器、不同试剂、不同操作人员，往往对结果还是有影响的。当然，结果出来了就好，无论白猫黑猫，抓到老鼠就是好猫！ 不过呐，就楼主的筛选条件，如果接合实验不是100%成功，那些接合试验阴性的菌株，其实还是值得商榷的！

看来楼主的老板对你的课题或试验的领域好像也不是很熟悉，所以才想到花大价钱去美国买。这也是楼主自己需要学习的地方。有些资源其实是很多的，周围会有很多同行的，相互交流一些资源很正常。发个邮件、打个电话，我想很多人是很乐意送你的，至少我愿意。

祝楼主实验顺利哈。

这只能说是你自己个人的经验。

关于筛选平板的亚胺培南浓度，2mg/L亚胺培南肯定是太高了，你能接过去说明你的碳青霉烯酶的耐药水平比较高，能够在2mg/L的平板上生长那么它的MIC就是4mg/L了，敏感株的MIC一般都<0,125mg/L，不可能在0.25-0.5mg/L的平板上生长，KPC有时可以达到这个水平（根据我多年的经验，含KPC的接合子亚胺培南的MIC一般为2-4mg/L，少数为1mg/L或8mg/L，甚至16mg/L），很多金属酶的碳青霉烯MIC是很低的（MIC也就0.25-0.5mg/L），用2mg/L亚胺培南是接不过去的，除非你的亚胺培南失效或部分失效导致浓度下降了。我一般用的是利福平耐药的EC600，在0.25mg/L的亚胺培南平板上是不会生长的。另外，正如你所说亚胺培南易失效，所以我们一般用美罗培南。如果你在医院工作，药房里的泰能（亚胺培南+西司他丁为1:1）就很好用了。随便怀疑别人的实验方法和结果是不太好的，大家都这样做出来你做不出来可能就是你自己的问题了。另外J53国内有很多实验室都有的，不必大费周章去美国买。

关于接合试验的操作过程，其实没有固定标准。

菌株的复苏就看习惯了，肠杆菌科细菌我们一般用弱筛选平板如中国蓝或者麦康凯，血平板也可以，当然普通琼脂平板也行，只要能生长。

受体菌和受体菌刮取单个菌落是有风险的，特别对于供体菌，因为耐药基因位于质粒上，那么就存在质粒丢失的风险，你可能没碰到过，做的多了就难说了。

接合前的细菌一般采用对数生长期较好，你摇18小时也能做出来说明这样也是可以的，我是没试过。KPC还是比较容易接的，NDM那就太容易，受体菌和受体菌混合几分钟就接过去了。

首先给楼主点个赞！我喜欢你这样的学生！

正如江南版主所言，我们做实验时不能轻易否定别人的方法。为什么需要有预实验？就是让大家试试文献提供的参考条件、或者本实验室以前建立的方法。别人能做出来，并不能代表你能做出来。不同实验室、不同仪器、不同试剂、不同操作人员，往往对结果还是有影响的。当然，结果出来了就好，无论白猫黑猫，抓到老鼠就是好猫！ 不过呐，就楼主的筛选条件，如果接合实验不是100%成功，那些接合试验阴性的菌株，其实还是值得商榷的！

看来楼主的老板对你的课题或试验的领域好像也不是很熟悉，所以才想到花大价钱去美国买。这也是楼主自己需要学习的地方。有些资源其实是很多的，周围会有很多同行的，相互交流一些资源很正常。发个邮件、打个电话，我想很多人是很乐意送你的，至少我愿意。

祝楼主实验顺利哈。

谢谢，我们的确对这个领域什么都不知道，所有东西包括耐药基因的检测都是从零开始，一开始走得很困难，我也不怕在这里自曝其短，就是希望把我的实验细节贴出来让大家狠狠地拍砖，因为东西都是我东拼西凑学来的，很多不规范不专业的东西！

我们在这里跟你说这些，不是什么说你们不专业、或者做得不好！我们的目的是，既然你们刚上路，可以多来园子里逛逛，多来这里问问。我相信这里很多人都会乐意帮你们的！至少如向老美买J53这事上面所花费的时间和金钱，大家都可以帮你们省掉的。当然，你们不差钱那是另外一回事了。另外，在这里多交流，也会对你们是一个提高，对来园子里的其他人也是一个学习的机会，何乐而不为。

请问你的大肠EC600在哪里买的呢？我也准备做这个实验，但是菌株找了好久没找到，谢谢。如果可以，能不能麻烦你拼一株给我，我出邮费，也可以用菌株交换，谢谢啦。期待你的回复

抱歉，打错了，仔细一看你用的是J53。哈哈