【求助】PCR疑难求解!问题很复杂,我已经摸索1个多月了,未果。。。。

楼主  收藏   举报   帖子创建时间:  2009-07-30 22:34 回复:12 关注量:249
最近一个月真是快疯掉了,啥结果都没有,历经煎熬啊,体系和温度都被我翻了个底朝天,可依然没有头绪,目的条带死也不出来,丁香园里的热心人帮我解解吧,想死的心都有了。
上游引物:CCGGAATTCCTAGCTGCTCTTACAG
下游引物:CGGCTCGAGTACAGCAGAATACTCAG
P人的目的基因,前10个是保护碱基+酶切位点。引物TM值是63.5,65度。
之前怀疑是引物的问题,让公司重新免费合成了一对,还是出不了结果。下面是我的摸索过程:
1. 我拿到引物后,首先以低TM值减5度为中心温度开始摸梯度,即58度,如附件1所示。1道 为DL2000,2-9道温度分别是54.5,55.2,56.2,57.4,58.6,59.8,60.8,61.5.看到前三道有smear。
2. 因此把温度下降到52.5度为中心梯度继续摸索,结果如图2所示。2-9道温度分别为49,49.7,50.7,51.9,53.1,54.3,55.3,56.结果看到2-8道均有smear,且5道即温度53度的smear较集中于我的目的条带位置(472bp),当时好开心,以为结果就快出来了。
3. 把温度梯度范围继续缩小,以51度为中心梯度,继续P。结果如图3所示。2-9道温度分别为48.5,49,49.7,50.6,51.4,52.2,53,53.5.全部都有smear,但第8及第9道仍可隐约看见smear中心接近目的条带位置。当时很失望,以为这次就能出结果的,因为之前的片段这样稍微摸索一下就出了很漂亮的目的带。
4. 温度摸到这一份上,觉得应该不是温度的问题了,于是我开始调整体系。之前用过此体系P内参,条带都很好,一直以为这是一个成熟的体系的。但凡事都有万一,我决定一试。首先调整酶的浓度,我的酶是MBI的普通taq酶,1U/L,25UL体系是用2.5UL;,于是我从2.5开始递减0.2直到1.5UL,结果啥都没有,除了引物二聚体。
5. 我想应该不是酶的问题,又把酶的浓度定回到2.5UL,开始调整镁离子的浓度,这是跟酶配套的镁离子,从2.5UL开始递减到1.5UL.结果也是啥都没有。
实验做到这里,我真的找不出原因了,请各位大侠也好,路过的也好,指点指点吧!看看这个思路对不对?还有哪里没想到的?接下来要怎样去做?
  • dongjuanhui 2009-07-30 22:35
    #1

    这是图2

  • dongjuanhui 2009-07-30 22:35
    #2

    这是图3

  • oxh8081 2009-07-31 00:16
    #3

    等高手看怎么解答

  • shanxue0103 2009-07-31 08:47
    #4

    你的模板是DNA吧,模板的DNA没有什么问题吗?怎么会扩出这个样子啊?你再重新跑一下模板DNA呗,是不是DNA已经降解了呢?再一个有没有可能你在PCR时模板的量太多了,怎么会有那么量的smear?

  • dongjuanhui 2009-07-31 09:13
    #5

    谢谢楼上!我的模板是CDNA。我每用一管新的CDNA之前都会先用内参试一下,都是很好,很亮。25UL体系加2UL的CDNA,然后跑胶的时候只要上1UL上样跑胶,这算是模板多了吗?

  • withme 2009-07-31 09:25
    #6

    首先:P人的目的基因,前10个是保护碱基+酶切位点。引物TM值是63.5,65度。
    这个TM是不对的,一看就没有60以上,这个10base是不能算在里面的。把实际的引物延长

  • dongjuanhui 2009-07-31 10:44
    #7

    我这两天重新设计引物试试。

  • 李传宝 2009-07-31 22:42
    #8

    引物设计的问题,或者是:公司有时会把引物合成错了,

  • dongjuanhui 2009-08-01 23:21
    #9

    嗯,我之前一直没考虑引物的问题,然后前段时间让公司重新合成了,这已经是新合成的引物P出来的,之前的更差,啥都没有。

  • 东南西北 2009-08-02 22:46
    #10

    对PCR实验不成功的分析,要考虑的因素很多,远远不止引物和退火温度2项,最好把信息提供的更全面。