【求助】QPCR扩增效率太低_PCR技术讨论圈_商圈

【求助】QPCR扩增效率太低

楼主收藏举报帖子创建时间: 2013-02-27 17:45 回复：22 关注量：415

大家好，我做QPCR基因扩增效率的时候，一个基因由于CT太大，所以只进行4个2倍的稀释度，二步法退火温度是61度扩增效率不高只有78%（图1）溶解曲线（图3），所以我做了三步法退火温度59度扩增效率反而更低了只有57%（图2）溶解曲线（图4），很奇怪，请教下大家看这是什么原因，该怎么改进呢？有看到资料说把引物浓度提高，不知道效果怎样。

med_cam 2013-05-31 05:12
#1

l风卷残云l
能否详细解释下这句话什么意思？本人数学不是很好。。。谢谢
举个简单例子说明这个问题：
1）假设地上有1000个绿豆。现在你闭上眼睛从中间切下去，那么大致能对半分，也就是500：500（1:1）的关系。
2）然后将其中的500再闭上眼睛从中间切下去，那么还是能大致对半分。
3）如此反复进行。。。。
4）当最后剩3个绿豆，现在再闭上眼睛从中间切下去，就有很大概率是一边3个，另一边0个（即全或无的关系）。
因此，如果绿豆数量多的时候，闭上眼睛从中间切下去，大致能对半分，这就是服从线性分布。
如最后绿豆数量减少到一定的时候，闭上眼睛从中间切下去，绝大部分情况是全或无的关系，这时就服从贝努里分布。

回归qPCR:
“绿豆” = “DNA”
“闭上眼睛从中间切下去” = “二倍稀释” （强调“闭上眼睛”是因为我们稀释时也看不见DNA，保证随机性）。
当DNA稀释服从线性分布时，这时的qPCR就是传统意义上的qPCR. 这时候的标准曲线才时一条直线。
当DNA稀释服从贝努里分布时，这时的qPCR叫做"digital PCR(数字PCR)". 为什么起这个名字呢？因为计算机存储是 0与1, 也就是全或无。以前大学生理学上提到过细胞动作电位的“全或无”现像也是这个道理，是数字信号，区号于模拟信号。
med_cam 2013-03-15 01:17
#2

2倍的稀释度很容易产生误差（枪头微小的残留可能就影响样品之间的稀释比例）。
再加上你本身样品CT值就很大，通常来说CT值大于32可信度就已经降低了（因为样品稀释度很高时就不服从正态分布，而是服从贝努里分布）。
所以你的标准曲线数据重现性会很差，计算出来的效率也会忽高忽低。
建议先用PCR扩增目的基因，然后再用PCR后产物（最好是10倍等比稀释7个梯度，每个梯度做三个重复）来做标准曲线。
刮胡刀进行曲 2013-02-28 00:31
#3

无所谓吧。pcr效率本来就很少95%的。多数都是90%就不错了。只要每次实验都做标准曲线就可以了。
zengyb1987 2013-03-01 10:41
#4

楼主是用那个公司的染料？最近我也在做实时荧光PCR，发现扩增效率也降低了，本来90%以上的，现在只有60%左右了，不知是不是染料原因？
shiliyu 2013-03-01 12:07
#5

我的是Thermo下的FINNZYMES
刮胡刀进行曲 2013-03-01 22:29
#6

zengyb1987
楼主是用那个公司的染料？最近我也在做实时荧光PCR，发现扩增效率也降低了，本来90%以上的，现在只有60%左右了，不知是不是染料原因？
可以说是染料原因，也可以说不是染料原因。

因为SYBR这个染料是靠嵌入DNA发光来检测DNA量的。所以必然会影响DNA复制的效率。另外SYBR是溶解在DMSO中的。如果量太大DMSO也会抑制PCR反应。
因此很多正常的引物用在SYBR里面都会效率下降，有时候需要重新设计引物。

但是只要质量合格，跟哪个公司关系不大。
zhangruiquan 2013-03-07 11:05
#7

好像理论上95%-105%是算比较有效的扩增。
exotoxin 2013-03-14 11:20
#8

我用的Evagreen，在ABI7500里扩增，用自带软件分析每次扩增效率都大于100%，一般都超过105%了。
med_cam 2013-03-15 01:17
#9

2倍的稀释度很容易产生误差（枪头微小的残留可能就影响样品之间的稀释比例）。
再加上你本身样品CT值就很大，通常来说CT值大于32可信度就已经降低了（因为样品稀释度很高时就不服从正态分布，而是服从贝努里分布）。
所以你的标准曲线数据重现性会很差，计算出来的效率也会忽高忽低。
建议先用PCR扩增目的基因，然后再用PCR后产物（最好是10倍等比稀释7个梯度，每个梯度做三个重复）来做标准曲线。
shiliyu 2013-03-15 13:06
#10

med_cam
2倍的稀释度很容易产生误差（枪头微小的残留可能就影响样品之间的稀释比例）。
再加上你本身样品CT值就很大，通常来说CT值大于32可信度就已经降低了（因为样品稀释度很高时就不服从正态分布，而是服从贝努里分布）。
所以你的标准曲线数据重现性会很差，计算出来的效率也会忽高忽低。
建议先用PCR扩增目的基因，然后再用PCR后产物（最好是10倍等比稀释7个梯度，每个梯度做三个重复）来做标准曲线。
谢谢，很好的建议！以后尝试下。就是有个问题，以前我相同方法，试剂什么也一样的情况下，这个基因CT值有30的，现在补做扩增效率，怎么也达不到30了，只有33左右。这是什么原因，模板降解了吗？我都是放在-20度的，就这次用的时候解冻了下。

med_cam 帖子创建时间: 2013-05-31 05:12

l风卷残云l
能否详细解释下这句话什么意思？本人数学不是很好。。。谢谢

举个简单例子说明这个问题：
1）假设地上有1000个绿豆。现在你闭上眼睛从中间切下去，那么大致能对半分，也就是500：500（1:1）的关系。
2）然后将其中的500再闭上眼睛从中间切下去，那么还是能大致对半分。
3）如此反复进行。。。。
4）当最后剩3个绿豆，现在再闭上眼睛从中间切下去，就有很大概率是一边3个，另一边0个（即全或无的关系）。
因此，如果绿豆数量多的时候，闭上眼睛从中间切下去，大致能对半分，这就是服从线性分布。
如最后绿豆数量减少到一定的时候，闭上眼睛从中间切下去，绝大部分情况是全或无的关系，这时就服从贝努里分布。

回归qPCR:
“绿豆” = “DNA”
“闭上眼睛从中间切下去” = “二倍稀释” （强调“闭上眼睛”是因为我们稀释时也看不见DNA，保证随机性）。
当DNA稀释服从线性分布时，这时的qPCR就是传统意义上的qPCR. 这时候的标准曲线才时一条直线。
当DNA稀释服从贝努里分布时，这时的qPCR叫做"digital PCR(数字PCR)". 为什么起这个名字呢？因为计算机存储是 0与1, 也就是全或无。以前大学生理学上提到过细胞动作电位的“全或无”现像也是这个道理，是数字信号，区号于模拟信号。

med_cam 帖子创建时间: 2013-03-15 01:17

2倍的稀释度很容易产生误差（枪头微小的残留可能就影响样品之间的稀释比例）。
再加上你本身样品CT值就很大，通常来说CT值大于32可信度就已经降低了（因为样品稀释度很高时就不服从正态分布，而是服从贝努里分布）。
所以你的标准曲线数据重现性会很差，计算出来的效率也会忽高忽低。
建议先用PCR扩增目的基因，然后再用PCR后产物（最好是10倍等比稀释7个梯度，每个梯度做三个重复）来做标准曲线。