RNAseq数据分析
RNAseq Data Analysis
实验原理
转录组是某个物种或者特定细胞类型产生的所有转录本的集合。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。基于Illumina高通量测序平台的转录组测序技术使能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供最全面的转录组信息。相对于传统的芯片杂交平台，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具。
实验流程
实验结果
对于得到的实验数据，我们提供专业的数据分析服务，分析包括如下分析项目：
一．测序质量分析对测序的原始数据进行初步质量分析，对低质量数据进行过滤，并给出测序质量信任度报告。
二．测序序列比对获得RNA-seq的原始数据后，首先需要将所有测序读段通过序列映射（mapping）定位到参考基因组上。我们通过与UCSC提供的标准参考序列（reference sequences）进行比对，结合客户要求选择不同的比对软件和参考序列。统计比对结果，例如唯一比对率，高质量比对率等。然后，我们可以基于多个数据库（客户自选）将测序结果定位到不同的注释中，比如基因组、外显子数据库、内含子数据库、UTR数据库、refseq基因库、miRNA数据库、ncRNA数据库、EST数据库、Ensemble数据库、调控位点数据库等等。然后给出测序结果在注释中的分配情况，制作成饼图进行展示。
三．测序序列可视化提供特定格式文件，帮助客户实现RNAseq中Reads的可视化.例如：IGV，UCSC browser，Samtools。
四．基因表达量定量对RNA-seq的比对结果用RPKM（Reads Per Kilobase of exon per Millionmapped sequence reads）的手段进行基因表达定量（Ali Mortazavi，2008）
五．表达水平整体分析对表达水平进行总体分析，制作PCA图、聚类分析图等。
六．基因差异表达筛选由于测序技术有更大的通量，并且可以获得新的转录本的信息，所以在做样本间不同表达基因的筛选的时候优势很大。对于不同的样本信息，采取不同的统计手段，比如student-t test, F-test等得到不同样本间特异表达的基因或基因集团。
七．基因本体分析（Gene Ontology Analysis）对于得到的特定基因分类，我们基于权威的GO数据库进行功能分析，并得到可能的富集功能，绘制柱形图和表格。
八．KEGG Pathway Analysis结合KEGG pathway等数据库，将得到的特定基因分类进行Pathway显著性分析。分析每个Pathway中所包含的差异基因个数，我们采取超几何分布检验等统计手段计算出反映Pathway中差异基因分布富集显著性的P-value，根据P-value大小判断差异基因在生物通路中富集程度，并最终得到显著富集的生物信号通路图。
九．差异基因上游序列的motif分析针对特定转录因子的实验，可对差异基因进行转录因子结合位点的motif分析，从而推测差异基因中有哪些基因可能直接受该转录因子调节。
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