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| 货号： | K10020F |
| 供应商： | 弘业新创抗体技术股份有限公司 |
| 规格： | 1mL |
镍柱：镍离子琼脂糖凝胶6FF预装柱（手动中压系统用）
镍离子琼脂糖凝胶6FF预装柱柱料说明
镍离子琼脂糖凝胶6FF通过高强度基质上螯合的金属镍离子选择性结合多个连续组氨酸残基。本产品具有高结合量和高稳定性，可用于含多聚组氨酸（通常是6个）标签重组蛋白的亲和层析纯化。镍离子琼脂糖凝胶6FF预装柱柱料说明
产品特色
基质：6%高交联的琼脂糖配基：金属镍离子
颗粒大小：90 μm（平均）
吸附载量：不小于25 mg 测试蛋白（15kD）/ml柱料
最大流速：500 cm/h
最高耐压：0.3 MPa
pH稳定性：3~13（长时间）；2~14（短时间）
使用温度：常温
预装柱成分
镍离子琼脂糖凝胶6FF保存条件
保存温度：4-8 ℃保存于20%乙醇溶液中
镍离子琼脂糖凝胶6FF预装柱（手动中压系统用）使用方法
待纯化样品处理：样品要充分溶解，避免出现堵塞现象，可以利用0.45μM滤膜过滤杂质。溶解样品的缓冲液最好与柱层析用的缓冲液一致，如20mM磷酸缓冲液或PBS（可以含有0.1M-0.5M NaCl）。
上柱前准备
平衡预装柱：
1.将预装柱用合适的乳胶管线连接至层析纯化的泵和检测器上，适当冲水，以检查预装柱各连接处是否漏水
2.用不小于5倍柱料体积的去离子水冲洗预装柱，以彻底除去保存液中含有的乙醇
3.用不小于5倍柱料体积的上样缓冲液平衡预装柱，至流出液pH值稳定达到上样缓冲液的pH值
上样纯化：
1.上样：将含多聚组氨酸标签的蛋白粗样上样至装填好的层析柱中，控制流速不要太快，以保证良好的结合效果。同时收集流出液（流穿）待后续分析。
2.洗杂：用上样缓冲液或洗涤缓冲液清洗层析柱，以洗涤非特异结合的杂质，可以收集洗杂流出液待后续分析。
3.洗脱：两种方法
方法1.降低pH洗脱（一步或者分步），大部分蛋白溶解于pH4-6。可选择柠檬酸盐，磷酸或者乙酸盐为洗脱缓冲液。逐步或一步降低pH至4，收集洗脱流出液
方法2.逐步提高咪唑的浓度（0-0.5M），以上样缓冲液中加入不同浓度的咪唑溶液为洗脱液，分步洗脱结合的蛋白，收集洗脱流出液
4.再生： 分常规清洗和彻底再生
a.一般在每次做完层析纯化后进行常规清洗
1.含0.5M咪唑缓冲液洗柱5个体积
2.去离子水洗柱5个柱体积
3.1M-2M NaCl洗柱5个柱体积
4.去离子水洗柱5个柱体积
5.0.5M NaOH洗柱5个柱体积
6.去离子水洗柱5个柱体积
b.层析柱在使用多次，一般5次以后就可以进行一次彻底再生
1.洗脱完样品的层析柱用0.05M EDTA，0.5M NaCl来洗涤3个柱体积，以彻底脱去镍离子
2.用3个柱体积的0.5M NaCl来洗干净EDTA
3.用3倍柱体积2M NaCl，反向洗脱层析柱
4.用1M NaOH洗涤30分钟
5.用5倍柱体积70%乙醇洗涤层析柱，或者先用含0.1-0.5%非离子去垢剂的0.1M乙酸溶液洗涤30分钟，然后再用5个柱床的70％乙醇去除去垢剂
6.最后用去离子水将层析柱洗涤干净。(以上每一洗涤步骤之间也可以用3倍体积去离子水洗涤一次)
c.使用预装柱时，为了避免死体积太大，可将预装柱中上层保护液吸出，留一厘米左后的液体，将AKTA纯化系统或中压纯化系统中的气泡排净，选择合适管路与之相连，保证预装柱内无气泡。装好之后，先用纯化水洗5~10个柱体积，再用缓冲液平衡5~10个柱体积，具体洗涤步骤按实际要求选择。
注意事项
常见问题1.样品不挂柱
----如果发现目的蛋白不挂柱，而是出现在上样流穿液中，应先验证表达的目的蛋白是否含有多聚组氨酸标签；
----检查pH和缓冲液成分，升高pH可提高结合能力，避免溶液中有EDTA加入；
----检查上样缓冲液中咪唑浓度是否过高，咪唑浓度一般不要超过10mM。
2.洗脱液中不含目的蛋白或者含量很低
----电泳检查目的蛋白表达量，看看目的蛋白表达量是否过低，如果是的话，通过优化条件或更换表达体系提高表达量；
----也可能是柱体积相对过大或上样量太少，可加大上样量；
----观察目的蛋白是否有降解，如果有可以加蛋白酶抑制剂。
3.洗脱产物中有多条杂带
----杂蛋白也可能含有与Ni离子结合的氨基酸残基，如组氨酸、半胱氨酸等，但这些结合都比多聚组氨酸（如His6）的结合弱，用咪唑浓度梯度或者pH值梯度洗脱有可能将不同结合强度的蛋白分别洗脱下来，从而达到分离目的蛋白和杂蛋白的目标；
----另外，镍离子螯合亲和层析填料具有较强的离子效应，在整个纯化溶液体系中加入100mM-500mM NaCl可以起到很好的降低因离子效应导致的非特异结合的问题，使得结合的目的蛋白纯度更高；
----杂蛋白与目的蛋白之间还有可能会通过疏水相互作用的结合在一起，共同挂在层析柱料上，这种情况下，可以在缓冲液加入去垢剂（如1%-2％Triton X-100或者2％Tween 20）等以解离杂蛋白与目的蛋白的结合。
4.包涵体表达样品如何纯化
----如果目的蛋白以包涵体形式表达，可以使用6M盐酸胍或者8 M尿素溶解变性包涵体，然后再进行纯化。
5.样品太粘稠
----主要原因是破菌不彻底导致大量核酸的存在，可以继续超声，或者加入适量核酸酶处理15分钟。
6.柱料变为棕色
----主要是指上样过程柱料由浅蓝色变为棕色，这是由于样品中还原剂浓度太高引起的，过高浓度的还原剂将二价镍离子还原为一价金属离子，从而使颜色发生改变。
预装柱产品目录及报价
| 货号 | 产品名称 | 规格 | 报价(元) |
| K10020F | 镍离子琼脂糖凝胶6FF预装柱（手动中压系统用） | 1mL | 150 |
| K10020G | 镍离子琼脂糖凝胶6FF预装柱（手动中压系统用） | 5mL | 480 |
必拓生物（Bio-tool）品牌介绍
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