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单细胞转录组测序文库构建最佳搭档
Discover-sc WTA Kit V2
- 模板起始量低：单个细胞或10pg Total RNA即可作为起始模板，进行高效扩增
- 扩增灵敏度高：使用LNA技术及精心优化的反应体系，大幅度增加了低表达基因的检出量
- 产物完整性好：通过双端引物扩增全长cDNA，获得全转录组信息，避免了5和3偏好性
- 操作成功率大：大大减少了RNA样品的处理，从而最大限度避免了样品损失的风险，提高了操作成功率
- 体积兼容性广：样品兼容体积可高达5 μl，兼容不同浓度的模板进行扩增
模板起始量低，扩增产物cDNA完整性好
10 pg 293T细胞Total RNA用Discover-scTM WTA Kit V2进行扩增，取1 μl cDNA扩增产物用Agilent 2100 Bioanalyzer进行分析。试剂盒以Oligo dT Primer为逆转录引物，并利用Discover-sc Reverse Transcriptase的Template-switching活性在cDNA的3’端添加一段接头序列，通过该接头序列进行后续的PCR扩增，获得全长cDNA扩增产物，同时避免了rRNA的污染。
文库质量分析—数据基本指标
Vazyme-1和Vazyme-2是单个293T细胞经过Discover-scTM WTA Kit V2 进行扩增，C-1和C-2是单个293T细胞经过用C公司单细胞转录组试剂盒进行扩增，取1 ng cDNA扩增产物经TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina®构建文库。以下均为此文库数据分析。
基因表达总体情况分析
| Sample | Expression Genes | Min. | Max | Mean | 1st Qu. | Median | 3st Qu. | Var. | Sum. |
| Vazyme-1 | 14807 | 0.002589318 | 5293.111 | 35.207 | 1.020643 | 4.717383 | 20.47274 | 19523.06 | 521310.1 |
| Vazyme-2 | 15138 | 0.004287681 | 4613 | 35.91853 | 0.954896 | 4.294688 | 18.79261 | 22444.61 | 543734.7 |
| C-1 | 14367 | 0.004498034 | 4568.409 | 39.20601 | 1.070605 | 4.631338 | 20.44749 | 24545.59 | 563272.8 |
| C-2 | 15285 | 0.003861415 | 4666.078 | 38.2787 | 0.887525 | 4.007046 | 17.91134 | 26059.52 | 585090 |
Discover-scTM WTA Kit V2试剂盒扩增产物检测灵敏度高，单个293T细胞检测到基因数高达15000个。
数据分布均一，无偏好性
左图为Vazyme-1测序片段在基因上的分布结果，右图为C-1测序片段在基因上的分布结果，数据显示Discover-scTM WTA Kit V2扩增很好的保证了基因5’和3’的覆盖。
表达重复相关性高
左图为Vazyme-1和Vazyme-2表达重复相关性分析，右图为C-1和C-2表达重复性相关性分析。数据结果表明表达重复相关性高于C公司。
Discover-scTM WTA Kit V2能以1-1000个细胞或10 pg-10 ng总RNA为模板，通过第一链cDNA合成及扩增，获取足够的用于序列分析的样本，从而解决了诸如单细胞等微量样本因RNA含量过低导致的无法使用常规mRNA-seq进行测序分析的技术难题。试剂盒以Oligo dT Primer为逆转录引物进行cDNA合成，并利用Discover-sc Reverse Transcriptase的Template-switching活性在cDNA的3’端添加一段接头序列，通过该接头序列进行后续的PCR扩增，获得全长cDNA扩增产物，有效避免了cDNA合成过程中的3’偏好性和rRNA的污染。
Discover-scTM WTA Kit V2是在Discover-scTM WTA Kit基础上开发的升级版本，其检测灵敏度、体积兼容性均得到了大幅度提升，更加适合低丰度基因及低浓度模板的检测。
