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喹诺***类快速检测试剂盒说明书一、原理试剂盒采用间接竞争 ELISA 方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物喹诺***类药物和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗喹诺***类药物抗体，加入酶标记物后，用 TMB 底物显色，样本吸光值与其所含残留喹诺***类药物的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出相应残留物喹诺***类药物的含量。二、试剂盒特性 试剂盒灵敏度： 1ppb 孵育温度： 25℃ 孵育时间： 30min～15min 样本检测下限 恩诺沙星（ENR）检测下限 1ppb环丙沙星（CIF）检测下限 约 1ppb氧氟沙星（OFL）检测下限 约 1ppb达氟沙星（DAN）检测下限 约 1ppb诺氟沙星（NOR）检测下限 约 0.5 ppb洛美沙星（LOM）检测下限 约 1ppb培氟沙星（PEF）检测下限 约 0.5ppb依诺沙星（ENO）检测下限 约 1ppb奥索利酸（OXO）检测下限 约 1ppb氟喹酸 （FLU）检测下限 约 1ppb麻保沙星（MAR）检测下限 约 1ppb氨氟沙星（AMI）检测下限 约 1ppb那氟沙星（NAD）检测下限 约 2ppb 交叉反应率 恩诺沙星（ENR） 100%环丙沙星（CIF） 92.88%氧氟沙星（OFL） 98.86%奥索利酸（OXO） 116.86%达氟沙星（DAN） 102.63%诺氟沙星（NOR） 148.65%洛美沙星（LOM） 86.24%培氟沙星（PEF） 156.60%依诺沙星（ENO） 98.97%氟喹酸（FLU） 96.73%麻保沙星（MAR） 110.63%氨氟沙星（AMI） 98.86%那氟沙星（NAD） 56.81%样本回收率组 织 80±15%血 清 80±15%蜂 蜜 75±15%三、试剂盒组成 1 微量测试孔 每条 8 孔，一板 12 条 标准液×6 瓶 0ppb 1ppb 2 3ppb 9ppb （1ml/瓶） 27ppb 81ppb 3 酶标记物 7ml 红色帽 4 抗体工作液 7ml 蓝色帽 5 底物 A 液 7ml 白色帽 6 底物 B 液 7ml 黑色帽 7 终止液 7ml 黄色帽 8 20X 浓缩洗涤液 40ml 白色帽 9 2X 浓缩复溶液 50ml 透明帽 四、所用仪器、试剂具备的仪器：微孔酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量 0.01g）微量移液器：单道 20～200ul、单道 100～1000ul、多道 250 ul试 剂：浓盐酸、二氯甲烷、正己烷、乙*、肝素钠、Na2HPO412H2O、 NaH2PO42H2O五、样本前处理步骤样本处理前须知处理任何样本时，都必须注意：（a）本试剂盒所检测的组织样本包括：动物组织、禽类和水产组织。eg:鸡、鸭、牛、兔、鱼、虾等。（b）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。（c）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。样本前处理需配制：配液 1 0.1M HCL 溶液：860l 浓盐酸加去离子水 100ml 溶解。配液 2 乙*-二氯甲烷混合溶液：V 乙*：V 二氯甲烷 = 1 : 4配液 3 pH7.2 0.02M PB 缓冲液：5.16g Na2HPO412H2O + 0.87g NaH2PO42H2O加去离子水 1L 溶解。配液 4 乙*-二氯甲烷-0.1MHCl 混合溶液100ml乙*-二氯甲烷(V乙*：V二氯甲烷 = 4 :1）混合溶液中加入 5ml 0.1M HCl 溶液。配液 5 用去离子水将 2X 浓缩复溶液按 1：1 稀释（1 份浓缩复溶液+1 份去离子水）用于样本复溶。（a）组织样本（鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼等）1、称 2.0±0.05g 均质过的组织样本于 50ml 离心管中；2、加入乙*-二氯甲烷混合溶液 8ml，振荡 5min，4000r/min 以上，15℃离心 10min；3、取 4ml 有机相至干燥容器中，56℃氮气吹干/旋转蒸发至干；4、用 1ml 稀释后的复溶液溶解干燥的残留物，加入正己烷 1ml 混合 30s，4000r/min 以上，15℃离心 5min；5、去除上层取下层 50l 液体用于分析。样本稀释倍数：1（b）血清样本的处理1、用加有肝素钠（20-30 单位/ml 血）的离心管采集鸡血样本（建议采血注射器也用肝素钠润洗），血样本室温静置 1h，待析出血浆后 4000r/min 以上，15℃离心 10min，取出血浆 1ml；2、加入乙*（无水）4ml 上下充分混合 5min， 4000r/min 以上，15℃离心 10min；3、移上清至另一离心管中，加入 2ml 0.02M PB 缓冲液，混匀；4、加入二氯甲烷 5ml，充分混匀 5min，4000r/min，15℃离心 10min，去上层，取下层有机相到干燥瓶中（清亮无杂质），50℃旋转蒸发至干/氮气吹干；5、用 1ml 稀释后的复溶液溶解干燥的残留物，加入正己烷 1ml 混合 30s，4000r/min 以上，15℃离心 5min；6、轻吸掉上层和中间白色杂质，取下层相 100l加入 100l 稀释后的复溶液，混合 30s；7、取 50l 用于分析。样本稀释倍数：2（c）鹈垩本处理方法：1、取 2.0±0.05g 蜂蜜样本于 50ml 离心管中；加入 8ml 乙*-二氯甲烷-0.1MHCl 混合溶液， 充分振荡 3min，15℃ 4000r/min 以上离心 10min；2、取 2ml 上清液于 56℃氮气或空气流吹干；3、加入 1ml 的样本复溶液，充分震荡 1min；4、取 50l 用于分析。样本稀释倍数: 2 倍六、 酶标免疫分析程序:测定前应须知：1、 使用前将需用试剂和板条的温度回升至室温（20-25℃）。2、 使用之后立即将所有试剂放回 2-8℃。3、 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是 ELISA 测定程序中的要点。4、 所有恒温孵育过程，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。操作步骤：5、将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒取出，置室温（20-25℃）平衡 30min 以上,注意每种液体试剂使用前均须摇匀。6、按需要取出微孔条及板架，将不用的微孔板重新密封，保存于 2-8℃，不要冷冻。7、配液：将 40ml 浓缩洗涤液（20 倍浓缩）用去离子水按照 1：19 稀释（1 份浓缩洗涤液+19 份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。8、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品均需做 2 孔平行，并记录标准孔的样本孔所在的位置。9、加标准品/样本 50l /孔，然后加酶标记物 50 μl/孔，再加入抗体工作液 50l/孔。轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，25℃环境反应 30min。10、 用洗涤液按每孔 250μl 洗板 4-5 次，每次浸泡 15-30 秒，拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。11、 显色：每孔加入底物 A 液 50l 再加入底物 B 液 50l，轻轻振荡混匀，25℃环境避光显色15min。12、 测定：每孔加入终止液 50l，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm 处（建议用双波长450/630nm 检测，在 5min 内读完数据），测定吸光度值（OD 值）。七、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第 1 种方法，定量判定用第 2 种方法。注意样本吸光度值与其所含喹诺***类药物量成负相关。1、粗略判定：用样本的平均吸光度值与标准品比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本 1 的吸光度值为0.238， 样本 2 的吸光度值为 0.946，标准液吸光度值分别是：0ppb 为 1.845； 1ppb 为 1.542；3ppb为1.130； 9ppb 为 0.635；27ppb 为 0.326； 81ppb为0.156。则样本 1 的浓度范围是 27ppb - 81ppb；样本 2 的浓度范围是 3ppb - 9ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中喹诺***类药物的实际浓度。2、定量分析（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0 标准）的吸光度值，再乘以 100%，即B百分吸光率（%）＝ ×100%B0B标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B00ng/ml 标准溶液的平均吸光度值（2）标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以喹诺***类标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中喹诺***类药物实际浓度。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）八、 注意事项1、 室温低于 25℃或试剂及标本未回到室温（20-25℃）会导致所有标准的 OD 值偏低。2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。4、 反应终止液为 2M 硫酸，避免接触皮肤。5、 不要使用过了有效日期的试剂盒；稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD 值变化；不要交换使用不同批号的盒中试剂。6、 不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。标准品 1 的吸光度值小于 0.5 时，表示试剂可能变质。8、 该试剂盒最佳反应温度为 25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。九、储藏条件和保质期1、 储藏条件：试剂盒于 2-8℃保存，不要冷冻。2、 保 质 期：该产品有效期为 1 年，生产日期见包装盒。提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然正常有效，不影响实验结
