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线粒体呼吸链/线粒体含量/线粒体活性/检测线粒体活性试剂盒联系人：陈天添 销售热线：13439225985线粒体复合体Ⅳ试剂盒说明书微量法 100 管/96 样正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C 氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细胞色素C 的氧化，并最终把电子传递给氧，生成水。测定原理：还原型细胞色素C 在550nm 有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C 生成氧化型细胞色素C，因此550nm 光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。试剂的组成和配制：试剂一：液体100mL×1 瓶，-20℃保存；试剂二：液体20mL×1 瓶，-20℃保存；试剂三：液体1.5mL×1 瓶，-20℃保存；试剂四：液体20mL×1 瓶，4℃保存；试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：1、 准确称取0.1g 组织或收集500 万细胞，加入1mL 试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。2、 将匀浆600g，4℃离心5min。3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心10min。4、 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做）。5、 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL 试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10 秒，重复30 次），用于复合体Ⅳ酶活性测定。测定步骤：1、 分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。2、 样本测定（1）工作液的配制：临用前将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂4℃可保存一周；（2）在微量石英比色皿或96 孔板中加入10μL 样本和200μL 工作液，混匀，立即记录550nm处初始吸光值A1 和 1min 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。注意点：若ΔA 大于0.2，需将样本用试剂二稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数），使A1-A2 小于0.2，可提高检测灵敏度。复合体Ⅳ活力单位的计算：a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：（1） 按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟催化降解1 nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。复合体Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。（2） 按样本鲜重计算单位的定义：每g 组织每分钟催化降解1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。复合体Ⅳ 活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷ （ ε×d ） ×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=222×ΔA÷W（3） 按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟催化降解1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。复合体Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.444×ΔAV 反总：反应体系总体积，2.1×10-4 L；ε：细胞色素C 摩尔消光系数，1.91×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。b.使用96 孔板测定的计算公式如下：（1） 按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟催化降解1 nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。复合体Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=2198×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。（2） 按样本鲜重计算单位的定义：每g 组织每分钟催化降解1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。复合体Ⅳ 活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷ （ ε×d ） ×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=444×ΔA÷W（3） 按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟催化降解1nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。复合体Ⅳ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.888×ΔAV 反总：反应体系总体积，2.1×10-4 L；ε：细胞色素C 摩尔消光系数，1.91×104 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。线粒体呼吸链/线粒体含量/线粒体活性/检测线粒体活性试剂盒联系人：陈天添 销售热线：13439225985
