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外周血NK分离液试剂盒1. 适用于各种动物血液及脏器组织本系列产品检索 2. 相关试剂及耗材 3. 注意事项 4. 应用 5. 产品性能指标 6. 贮藏及保存期限 7. 实验前准备 8. NK 细胞分离液试剂盒使用方法说明及图例 9. HES-TBD550 使用说明 10. 组织单细胞悬液的制备 11. 生产企业 12. 参考文献 2. .. 注意事项 A． 本分离液是敏光型的，在运输和贮藏过程中应在 18℃-25℃避光保存，启封后置 4℃保存避免微生物污染。另外，本品为真空包装，未启封前置于 10℃ 以下易出现白色结晶，影响分离效果。B． 待分离的血液、组织及细胞要求新鲜，避免冷冻和冷藏。分离液和所分离样本一定在20℃水浴箱中复温20分钟保证分离液和所分离样本温度在20℃±2℃时分离效果最好，且所有操作过程一定要在无菌条件下进行。C． 由于各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能影响分离效果，用户可以调节离心转数，调节离心的时间，摸索最佳的分离条件（具体分离条件各实验室自定）。D． 最好使用无静电反应的离心管，推荐使用未经过碱处理的玻璃离心管。E． 最优抗凝剂选择：EDTA、枸橼酸、肝素。应注意在血液稀释过程中应去除抗凝剂体积。 F． 分离过程中所用其他试剂如：羟乙已基淀粉 550、全血及组织稀释液、细胞洗涤液及红细胞裂解液等以我公司产品为最优选择，本公司相关系列产品无菌、无病毒、无支原体、低内毒素水平且无细胞毒性，所获得的细胞可保持完好的生物活性和完整的细胞形态。4. .. 应 4. 用适用于从人或各种动物血液或脏器组织中分离 NK 细胞。5.. . . 产品性能指标pH 7.0-7.5 渗透压 280-340mOsmol/kg 内毒素 ≤0.5...EU/ml无菌 直接接种培养 14 天后培养基澄清 澄明度及不溶性颗粒物 每 50ml 溶液中含 10μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 20 粒以下含 25μm 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 以上的不溶性微粒 5 粒以下6.. . . 贮藏及保存期限 贮藏及保存期限18℃-25℃避光保存，有效期两年。启封后置 4℃保存，有效期一周。 注：：：：若保证无微生物污染，启封后可置 4℃长期保存。但应注意保存温度较低时本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。 7. .. 实验前准备 7. 实验前准备A． 试剂 NK 细胞分离液试剂盒所含试剂、组织匀浆液、胎牛血清 B． 器材 玻璃离心管、玻璃滴管 水平转子离心机、无菌工作台 A. 在 10ml 或 15ml 玻璃离心管中依次小心加入 B、D 两种液体各 2ml,制成梯度界面（各液面分层一定要清晰）； B．取 1ml新鲜抗凝血或组织单细胞悬液（细胞浓度为2×108-1×109个/ml，具体制备方法参照“10.组织单细胞悬液的制备”）与试剂E 1：1混合后再按2:1的比例与全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）混匀。20℃-30℃静置20-30分钟，吸取上层浑浊液备用，弃去大部分红细胞； C．将步骤B中吸取的上层浑浊液小心加于D液之液面上； D. 以400g（约1500转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)； 此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层；为上清液层（包含血小板和血浆）。第二层；；；；为 NK 细胞层。。。。第三层；为浑浊分离液层（含大量 T、B 及粒细胞）。第四层；为极少量红细胞层。收集第二层 NK 细胞放入含 4-5ml 细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以 500g（约 1800 转/分）离心 20 分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤 2 次即得所需 NK 细胞。 注：：：：A. 提取率约为 80%。 B．分离大量样品时，具体操作方法请参照我公司“淋巴细胞快速分离技巧”，查询路径：HES 是从支链淀粉衍生出来的，是富含淀粉的复合物，其生理和化学特性主要由羟乙已基取代度即取代级、平均分子量决定。大量实验表明平均分子量越大对红细胞的凝集作用越强，有效提高红细胞的沉降速度，从而使红细胞与其它细胞分离。故而，使用 HES-TBD550（羟乙基淀粉 550）沉淀法是一种高效的细胞分离方法。 间充质干细胞(mesenchymal stem cells ,MSCs) 是指一群可向成骨细胞、成脂肪细胞、骨髓基质细胞、肝脏细胞、心肌细胞和神经细胞等多种细胞分化的多潜能组织干细胞,是在细胞治疗、基因治疗中有效发挥作用的理想工程细胞。MSCs 不仅存在于骨髓,也可从脐血、外周血中以及脂肪组织、肌肉、胎儿器官、大脑、牙齿中分离。UCB - MSCs 的分离、筛选、增殖、分化与脐血样本的选择、培养基的差异以及分离、扩增分化过程中操作技术等多种因素有关。目前用于 UCB - MSCs 分离的方法有:贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪法和免疫磁珠法。流式细胞仪法对细胞损伤较大，免疫磁珠法价格相对较贵且由于抗原抗体反应也容易改变细胞原有特性，而 HES-TBD550（羟乙已基淀粉 550）联合密度梯度离心法常与贴壁筛选法结合使用,可提高所得 UCB - MSCs 的纯度，目前研究多采用此法。国内不少学者采用羟乙已基淀粉沉淀红细胞，然后再进行离心分离单个核细胞，也取得不错结果。实验证明采用随机数字表法，将每份脐血随机分入两个不同处理组，从而将脐血样本的个体差异减小到最小程度。结果证实，HES-TBD550（羟乙已基淀粉 550）联合密度梯度离心法获得的有核细胞数量明显多于 FICOLL 密度梯度离心法。本实验采用的羟乙已基淀粉商品名为 HES-TBD550（羟乙已已基淀粉 550），克分子渗透压为 308mosm／L，胶体渗透压为 68／36 mmHg,可影响红细胞集聚性沉降率。红细胞集聚是可递性桥接结构形成的结果，由大的 HES-TBD550（羟乙已基淀粉 550）分子处在红细胞之间联接而成。HES-TBD550（羟乙已基淀粉 550）同时还阻碍白细胞和内皮细胞的黏附，并使平均血小板容积呈现微弱地降低，从而有轻度抑制血小板集聚的功能。脐血经 HES-TBD550（羟乙一基淀粉 550）处理后，可使红细胞沉积至试管底，对其它主要成分包括干细胞无影响。经这样处理后，实验时间相对较短（平均为 1.5 h），步骤相对较少，细胞污染几率小，从而使细胞数损失减少。结论证明，与相应的干细胞分离液联合分离使用羟乙已基淀粉沉淀法是一种高效的脐血干细胞分离方法。10.. . . 组织单细胞悬液的制备注：：：：A.. .. 本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法 本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法 本说明只提供机械匀浆制备单细胞悬液的方法，，，，酶消化法由于各实验室选取的消化 酶消化法由于各实验室选取的消化酶种类各不相同，，，，请各实验室自行选择进行试验 请各实验室自行选择进行试验 请各实验室自行选择进行试验。。。。 B. .. 全过程及所需试剂要求无菌环境 B. 全过程及所需试剂要求无菌环境 全过程及所需试剂要求无菌环境。。。。 剪碎法：：：：将组织块放入平皿后，加入少量组织匀浆液及 20%胎牛血清；用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入 5ml 组织匀浆液及 20%胎牛血清；用吸管吸取组织匀浆，用 100 目不锈钢滤网(另购)过滤到试管内；离心沉淀 1500转/分×3 min，再用细胞洗涤液清洗 3次，每次以 500rpm短时低速离心除去细胞碎片，以 200 目不锈钢滤网（另购）过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×107个/ml。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用 20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为 2×108-1×109个/ml 的单细胞悬液备用。 匀浆器法：用眼科剪将组织剪成小块；放入 70ml 组织研磨器内，加入 2ml 组织匀浆液及 20% 匀浆器法胎牛血清；缓慢转动研棒，研磨至匀浆；用 5ml 组织匀浆液及 20%胎牛血清冲洗研器；收集细胞悬液，经 200 目不锈钢滤网（另购）过滤；离心沉淀 800rpm×2min ，再用细胞洗涤液洗 3 次，离心沉淀。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×107个/ml。常温下放置, 待测细胞的活力。分离前用 20%胎牛血清或全血及组织稀释液悬起细胞浓度为 2×108-1×109 个/ml 的单细胞悬液备用。 细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法。一般利用计数板（血球计数板）进行。既可用于分离（散）细胞培养接种前计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，也可用于对培养物的细胞数量进行计数。不论计数的对象如何，均须制备分散的细胞悬液。 计数与计算过程 1）、在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片。 2）、用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止。 3）、置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。 4）、按下式计数细胞悬液的密度： 细胞密度＝（4 个大格细胞总数/4）×104个/ml×稀释倍数 公式中乘以 104因为计数板中每一个大格的体积为： 1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3细胞计数要点： 细胞计数要点：：： A． 进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于 104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；显微镜下计数时，遇到 2 个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团>10％，说明细胞分散不充分; 或细胞数<200 个/10mm2或="">500 个/10 mm2 时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。 B． 要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。 C． 取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确； D． 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。 E． 操作时，注意盖玻片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。 初学者易犯的错误： 初学者易犯的错误：：： A． 计数前未将待测悬液吹打均匀。 B． 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。 C． 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。
