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革兰氏阳性菌质粒大量提取试剂盒
产品内容：
| 溶菌酶 | 10ml |
| RNaseA(10mg/ml） | 1ml |
| 溶液Ⅰ | 60ml |
| 溶液Ⅱ | 60ml |
| 溶液Ⅲ | 80ml |
| 漂洗液 | 15ml×2 |
| 洗脱液 | 30ml |
| 吸附柱 | 10个 |
| 收集管(50ml) | 10个 |
| 说明书 | 1份 |
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。溶液Ⅰ在使用前先加入 RNaseA（将试剂盒中提供的 RNaseA 全部加入） ，混匀，置于 2-8℃保存。如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
操作步骤：
1、取 50-200ml 细菌培养物，11000rpm 离心 5min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
2、向留有菌体沉淀的离心管中加入 5ml 溶液Ⅰ和 1ml 溶菌酶，混匀。37℃水浴 30 min 以上（根据菌液量可适当加长水浴时间，请先检查溶液Ⅰ是否已加入 RNaseA），使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入 5ml 溶液Ⅱ，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。注意：混匀一定要温和以免污染基因组 DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过 5 min，以免质粒受到破坏。
4、向离心管中加入 7ml 溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转 6-8 次， 充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。 11000rpm离心 10 min ，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。注意：溶液Ⅲ加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
5、将上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室温放置 2min，11000rpm 离心 2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中( 如果一次加不完，可分两次吸附) 。
6、向吸附柱中加入 8ml 漂洗液( 使用前请先检查是否已加入无水乙醇) ，11000rpm离心 2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入 6ml 漂洗液，11000rpm离心 2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
8、11000rpm 离心 5min，将吸附柱敞口置于室温或 50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR 等。
9、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加 1-2ml 经 65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，11000rpm离心 2min，收集质粒DNA溶液。
10、（可选）为了增加质粒的回收率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置 5min， 11000rpm离心 2min。
注意事项：
1、使用前请先检查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出现混浊，如有混浊现象，可在 37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复
澄清后再使用。
2、洗脱缓冲液体积不应少于 500ul，体积过小影响回收效率；洗脱液的 pH 值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其 pH 值在 8.0 左右( 可用 NaOH 将水的 pH 值调至此范围) ，pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率。DNA产物应保存在-20 ℃，以防 DNA降解。
3、如果所提质粒为低拷贝质粒或大于 10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，使用 400-800ml 过夜培养物，同时比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。
4、 DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰， OD260 值为 1 相当于大约 50 μg/ml 双链DNA、40 μg/ml 单链DNA。OD260/OD280比值应为 1.7-1.9 ，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。
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