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Hieff NGSTM OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina
产品信息
| 产品名称 | 产品编号 | 规格 | 储存 | 价格（元） |
| Hieff NGSTM OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina® | 12203ES08 | 8 libraries | -20℃ | 3656.00 |
| 12203ES24 | 24 libraries | -20℃ | 7486.00 | |
| 12203ES96 | 96 libraries | -20℃ | 28567.00 |
产品描述
Hieff NGSTM OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina®是针对Illumina®高通量测序平台专业开发设计的新一代酶切法建库试剂盒。与传统的建库法比较，本品采用高质量的酶学组成，摆脱了繁琐的超声过程，具有优秀的文库转化率与扩增效率，可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本的建库。经测序验证，不同GC含量的样本，均可获得优异的测序结果，文库覆盖高，均一性好，偏好性低，使建库变得更加简单。
一、关于操作
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。
4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。
5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次**钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。
二、关于DN**段化
1. 本试剂盒为酶切法片段化DNA。
2. 本试剂盒兼容范围为500 pg – 100 ng Input DNA。应尽可能使用A260/A280 = 1.8-2.0的高质量Input DNA。
3. Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐，可能会影响后续实验，建议将DNA稀释在TE Buffer中进行片段化。请勿使用EDTA终止反应，65℃加热即可使片段化酶失活。
4. 参照片段化步骤可将DNA酶切为150-550 bp左右，为保证优质稳定的片段化效果，片段化过程请于冰上操作。
三、关于接头连接（Adapter Ligation）
1. 针对Illumina®测序平台，Yeasen提供48种Indexed Adapters：Cat#12615，Hieff NGSTM Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1（12种）；Cat#12616，Hieff NGSTM Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 2（12种）；Cat#12617，Hieff NGSTM Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 3（12种）；Cat#12618，Hieff NGSTM Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 4（12种）。
2. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer；用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表1列举了使用本试剂盒，不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。
四、关于磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）
1. DN**段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前，或接头连接后，或文库扩增后进行。
2. 当Input DNA质量≥50 ng，您可选择在接头连接后分选；如Input DNA质量<50 ng，建议您在文库扩增后进行分选。
3. Ligation Enhancer中包含高浓度的PEG，会对双轮分选产生显著影响。因此，如在接头连接后进行长度分选，必须先进行纯化步骤，再进行双轮分选步骤；如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选，可直接进行双轮磁珠分选步骤。
4. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。
5. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
6. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。
7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
8. 进行长度分选时，初始样品体积应尽量≥100 μL，不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。
9. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
10. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用TE Buffer洗脱，产物可于4°C可保存1-2周，-20°C可保存1个月。
五、关于文库扩增（Library Amplification）
文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒，获得600 ng文库的推荐循环数。
六、关于文库质检（Library Quality Analysis）
1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。
3. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。
4. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®、PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。
5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
使用方法
一、自备材料
1. 纯化磁珠：Cat#12601，Hieff NGSTM DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效产品。
2. DNA质控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。
3. DNA Adapter：可选Yeasen Cat#12615，Hieff NGSTM Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1；Cat#12616，Hieff NGSTM Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 2；Cat#12617，Hieff NGSTM Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 3；Cat#12618，Hieff NGSTM Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 4；或其他等效产品。
4. 其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。
二、操作流程
三、操作步骤
3.1 DN**段化（DNA Fragment）
该步骤将基因组DN**段化，片段化之后加热使酶失活。
1. 将表3中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 于冰上配制表3反应体系。
3.2 末端修复/dA尾添加（End Preparation/dA-Taling）
该步骤将片段化DNA进行末端修复和dA尾添加。
1. 将表5中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 于无菌PCR管中配制表5所示反应体系。
3.3 接头连接（Adapter Ligation）
该步骤将3.2步骤的产物末端，连接特定的Illumina®接头。
1. 根据Input DNA量按表1稀释Adapter至合适浓度。
2. 将表7中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
3. 于3.2步骤PCR管中配制表7所示反应体系。
3.4 连接产物磁珠纯化（Post Ligation Clean Up）
该步骤使用磁珠对3.3步骤的产物进行纯化或分选。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物。
3.4.1 纯化操作步骤：
1. 准备工作：将Hieff NGSTM DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取80 μL Hieff NGSTM DNA Selection Beads（0.8×，Beads:DNA=0.8:1）至Adapter Ligation产物中，室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
8. 将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱：
1）如产物无需进行片段分选，直接加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。【注：如纯化产物如需保存，可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠。
2）如产物需进行双轮分选，加入102 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。【注：如纯化产物如需保存，可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，切勿触碰磁珠。
3.4.2 双轮分选操作步骤：
1. 准备工作：将Hieff NGSTM DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡约30 min。配制80%乙醇。
2. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。
3. 根据DN**段长度要求，参考表9向上述100 μL DNA上清中加入第一轮分选磁珠，涡旋混匀或移液器吹打10次混匀。
4. 室温孵育5 min。
5. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中。
6. 参考表9向上清中加入第二轮分选磁珠。
7. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。
8. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
9. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。
10. 重复步骤9。
11. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约5 min）。
12. 将PCR管从磁力架中取出，加入适量21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。
13. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移20 μL上清至干净的管中。
3.5 文库扩增（Library Amplification）
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。
1. 将表10中试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 于无菌PCR管中配制表10所示反应体系。
3.6 扩增产物磁珠纯化或分选（Post Amplification Clean Up/Size Selection）
同3.4.1步骤中纯化操作步骤。使用Hieff NGSTM DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）纯化文库扩增产物。
如需分选，操作方法同3.4.2双轮分选步骤（纯化步骤可省略）。
3.7 文库质量控制
通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项六。
3.8 参考实例
使用Hieff NGSTM OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina®对50 ng Human gDNA样本建库（0.7× 0.2×双轮分选），结果使用Agilent 2100 DNA 1000 Chip进行检测。
