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HB181026
Hieff NGSTM MaxUp Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina®
mRNA建库试剂盒
产品信息
| 产品名称 | 产品编号 | 规格 | 储存 | 价格（元） |
| Hieff NGSTM MaxUp Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina® | 12301ES08 | 8 T | 详见保存方法 | 2826.00 |
| 12301ES24 | 24 T | 详见保存方法 | 9756.00 | |
| 12301ES96 | 96 T | 详见保存方法 | 32856.00 |
产品描述
Hieff NGSTM MaxUp Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina®是针对Illumina®高通量测序平台专门研发的用于mRNA转录组文库构建试剂盒，本试剂盒cDNA二链合成模块配有两种buffer，客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。本产品适用于起始模板为10 ng-1μg不同来源真核生物总RNA样本。经过mRNA分离、片段化、链双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增，总RNA样品最终转化为适用于Illumina®平台测序的文库。
试剂盒包含三个独立模块，BOX-I的核心为纯化mRNA所需的poly（A）磁珠。BOX-II包含mRNA片段化试剂，反转录试剂，常规和链特异性dscDNA合成所需的所有试剂。其中链特异性二链合成buffer中将dTTP替换为dUTP，使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧***的DNA模板，实现链特异性。BOX-III实际上是一个高效的微量DNA文库构建试剂盒，来自我公司的Hieff NGSTM MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumina®。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。
产品组分
| 组分编号和名称 | 12301ES08 | 12301ES24 | 12301ES96 | |||
| BOX-I | 12603-A |
| mRNA Capture Beads | 0.4 mL | 1.2 mL | 4.8 mL |
| 12603-B |
| Bead Binding Buffer | 0.4 mL | 1.2 mL | 4.8 mL | |
| 12603-C |
| Beads Wash Buffer | 5 mL | 15 mL | 60 mL | |
| 12603-D |
| Tris Buffer | 0.4 mL | 1.2 mL | 4.8 mL | |
| BOX-II | 12250-A |
| Frag/Prime Buffer | 150 μL | 450 μL | 900 μL×2 |
| 12250-B |
| 1st Strand Synthesis Enzyme Mix | 16 μL | 48 μL | 192 μL | |
| 12250-C |
| Strand Specificity Reagent | 50 μL | 150 μL | 580 μL | |
| 12250-D |
| 2nd Strand Synthesis Buffer (with dNTP) | 162 μL | 485 μL | 965 μL×2 | |
| 12250-E |
| 2nd Strand Synthesis Buffer (with dUTP) | 162 μL | 485 μL | 965 μL×2 | |
| 12250-F |
| 2nd Strand Synthesis Enzyme Mix | 41 μL | 121 μL | 482 μL | |
| BOX-III | 12200-A |
| Endprep Buffer | 48 μL | 144 μL | 576 μL |
| 12200-B |
| Endprep Enzyme | 32 μL | 96 μL | 384 μL | |
| 12200-C |
| Ligation Enhancer | 240 μL | 720 μL | 4×720 μL | |
| 12200-D |
| Quick T4 DNA Ligase | 40 μL | 120 μL | 480 μL | |
| 12200-E |
| 2× Super CanaceTM II High-Fidelity Mix | 200 μL | 600 μL | 4×600 μL | |
| 12200-F |
| Primer Mix | 40 μL | 120 μL | 480 μL | |
运输与保存方法
冰袋运输。效期一年。存储温度如下，切不可搞错！
Box I：2-8℃保存；Box II：-20℃保存；Box III：-20℃保存。
注意事项
一、 关于操作
1.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2.请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。
3.推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
4.请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。
5.PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。
二、应用范围
本试剂盒适用于起始模板量为10-1000 ng（体积≤50 μL）的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低，体积超过50 μL，可使用Hieff NGSTM RNA Cleaner磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Boanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测，RIN值要求＞7，以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。
本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo d(T)磁珠，只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的mRNA，如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外，FFPE样本中的mRNA降解严重，通常无完整的poly(A)尾结构，故亦无法使用本试剂盒进行建库。
本试剂盒所制备文库可进行多种RNA-Seq应用，包括：
基因表达（gene expression）
单核苷酸变异检测（single nucleotide variation discovery）
基因融合鉴定（gene fusion identification）
剪切变异体分析（splice variant analysis）
三、关于接头连接（Adapter Ligation）
1.本试剂盒推荐使用短接头（也称为小Y接头、不完整接头）进行建库，目前我公司可提供单端 96种 Index Kit 和双端 384 种 Index Kit。
单端 96 种 Index Kit：Cat#12611，Hieff NGSTM 96 Single Index Primer Kit for Illumina® , Set 1（48 种）; Cat#12612，Hieff NGSTM 96 Single Index Primer Kit for Illumina®, Set 2（48 种）。
双端 384 种 Index Kit：Cat#12613，Hieff NGSTM 384 Dual Index Primer Kit for Illumina® , Set 1（96 种）; Cat#12614，Hieff NGSTM 384 Dual Index Primer Kit for Illumina® , Set 2（96 种）。
2.我们建议选用高质量的商业化接头，如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。
3.使用接头时，请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解链。
4.建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4°C保存48小时。
表1 Input Total RNA量与接头浓度推荐表
| Input Total RNA | Adapter stock concentration |
| 10–100 ng | 0.15 μM |
| 100–499 ng | 1.5 μM |
| 500–1000 ng | 5 μM |
四、关于磁珠纯化与分选（Beads-based Clean Up and Size Selection）
1.建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGSTM DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。
2.磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。
3.磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
4.转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。
5.磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。
6.产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
7.DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存1周，-20°C可保存1个月。
五、关于文库扩增（Library Amplification）
1.本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。
2.如果您使用barcoded adapter（也成为长接头、大Y接头），可使用本试剂盒提供的引物Primer mix进行扩增；如果使用的是“短接头”或者叫“小Y接头”，则需要使用index primers进行扩增，加上相应的barcodes。
3.文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增，Input Total RNA量与相应扩增循环数的推荐。
表2 Input Total RNA量与扩增循环数推荐表*
| Input Total RNA | Number of cycles |
| 10 ng | 15–16 |
| 100 ng | 12-14 |
| 1000 ng | 8–10 |
【注】：*如使用链特异性文库构建方案，产量会相对减少，故选择高的循环数；否则，低循环数已经足够获得测序文库。当使用的总RNA质量较差时，可适当增加1-2循环。
六、关于文库质检（Library Quality Analysis）
1.通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
2.文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。
3.推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。
4.文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。
5.文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
使用方法
一、自备材料
1.纯化磁珠：Hieff NGSTM DNA Selection Beads（Cat#12601）或AMPure XP Beads（Cat#A63880）或其他等效产品。
2.RNA质控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。
3.Adapters：barcoded adapter（长接头）或者无barcode的短接头试剂盒。
4.文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。
5.其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。
二、操作流程
图1 mRNA建库试剂盒操作流程
三、操作步骤
3.1 mRNA纯化和片段化（mRNA Purification and Fragmentation）
1.将mRNA Capture Beads从2-8℃取出，静置使其温度平衡至室温，约30 min。
2.准备一个Nuclease free离心管，将0.01-1 μg总RNA溶解至50 μL Nuclease free水中，冰上放置备用。
3.颠倒或旋涡振荡混匀磁珠，吸取50 μL磁珠悬液加入至50 μL总RNA样品中，用移液器吹打6次，使其充分混匀。
4.将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中，65℃，5 min；4℃，hold，使得RNA变性。
5.室温孵育5 min，使mRNA与磁珠完全结合。
6.将样品置于磁力架中，室温静置5 min，使mRNA与总RNA分离，小心移除上清。
7.将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。将样品置于磁力架中，
室温静置5 min，小心移除上清。
8.重复步骤7，共洗涤两次。
9.将样品从磁力架上取出，加入50 μL Tris Buffer重悬磁珠，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。
10.将样品置于PCR仪中，80℃，2 min；25℃，hold，将mRNA洗脱下来。
11.加入50 μL Beads Binding Buffer，用移液器反复吹打6次以彻底混匀。
12.室温放置5 min，使mRNA结合到磁珠上。
13.将样品置于磁力架中，室温静置5 min，小心移除上清。
14.将样品从磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer，用移液器反复吹打6次以彻底混匀，将样品重新放回至磁力架中，室温静置5 min，吸掉全部上清。
【注】：最后需要用10 μL移液器吸干净残留液体。
15.将样品从磁力架上取出，用18.5 μL Frag/Prime buffer重悬磁珠，用移液器吹打6次以彻底混匀；将样品置于PCR仪中（预设为94℃），根据插入片段大小的需要，可参考表3选择片段化程序，但不同物种片段化的效果有差异，客户可先根据自己的情况，做个片段化时间的梯度，比如5、10、15 min。等合成双链cDNA后，使用Agilent 2100分析大小。
表3 mRNA片段化程序选择
| 插入片段大小（bp） | 打断程序 | Hold |
| 150-200 | 94°C，10~15 min； | 4°C |
| 200-300 | 94°C，~10 min； | 4°C |
| 300~400 | 94°C，~8 min； | 4°C |
| 400-700 | 94°C，~6 min | 4°C |
16. 片段化程序结束后，立即将样品置于磁力架中，转移17 μL上清至一个新的nuclease free离心管中，立刻进入第一链合成反应。
3.2 双链cDNA的合成与纯化（cDNA Synthesis and Purification）
第一链cDNA的合成：
1. 将1st Strand Synthesis Reaction Buffer从-20°C取出，解冻后颠倒混匀。按表4所示，配制第一链cDNA合成的反应液。
表4 第一链cDNA合成反应体系
| 名称 | 体积（μL） |
| Fragmented mRNA | 17 |
| Strand Specificity Reagent | 6 |
| 1st Strand Synthesis Enzyme Mix | 2 |
2. 使用移液器轻轻吹打或涡旋震荡混匀，瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表5所示设置反应程序，进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。
表5 第一链cDNA合成反应程序
| 温度 | 时间 |
| 热盖 105°C | On |
| 25°C | 10 min |
| 42°C | 15 min |
| 70°C | 15 min |
| 4°C | Hold |
第二链cDNA的合成：
1. 将2nd Strand Synthesis Buffer从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀；按照表6所示，配制第二链cDNA合成反应液。
表6 第二链cDNA合成反应体系
| 名称 | 体积（μL） |
| 1st Strand cDNA | 25 μL |
| 2nd Strand Synthesis Buffer (with dNTP or dUTP)* | 20 μL |
| 2nd Strand Synthesis Enzyme Mix | 5 μL |
【注】：*如构建普通mRNA文库，请使用含dNTP的buffer；如构建链特异性mRNA文库，请使用含dUTP的buffer。
2. 使用移液器轻轻吹打或涡旋震荡混匀，瞬离将反应液离心至管底。
3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表7所示设置反应程序，进行第二链cDNA的合成。
表7 第二链cDNA合成反应程序
| 温度 | 时间 |
| 热盖 105°C | Off |
| 16°C | 1 h |
| 4°C | Hold |
双链cDNA纯化：
该步骤将对获得的双链cDNA进行纯化。
1. 将Hieff NGSTM DNA Selection Beads DNA (Cat#12601)提前30 min从2-8℃取出，室温静置使其温度平衡至室温。
2. 颠倒或旋涡振荡使Hieff NGSTM DNA Selection Beads充分混匀，吸取90 μL (1.8 ×)磁珠悬液加入到第二链cDNA样品（50 μL）中，涡旋振荡或使用移液器吹打使其充分混匀。
3. 室温孵育5 min。
4. 磁力架上静置5 min。待溶液澄清后，保持样品始终处于磁力架中，小心移除上清。
5. 保持样品始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠(注意不要吹散磁珠)，室温孵育30 sec，小心移除上清。
6. 重复上一步，总计漂洗2次。
7. 保持样品始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5 min。
8. 将样品从磁力架中取出，加入51 μL nuclease free水，涡旋振荡或使用移液器吹打充分混匀，室温静置5 min。瞬离后在磁力架上静置5 min，待溶液澄清后，小心吸取50 μL上清至一个新的nuclease free离心管中。
3.3 末端修复/dA尾添加（End Repair/dA-Tailing）
该步骤将片段化的双链cDNA末端补平，并进行5’端***酸化和3’端加dA尾。
1. 将表8中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 于无菌PCR管中配制表8所示反应体系。
表8 末端修复/dA尾添加反应体系
| 名称 | 体积（μL） |
| Fragmented dscDNA | 50 |
| Endprep Buffer | 6 |
| Endprep Enzyme | 4 |
3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。
4. 将上述PCR管置于PCR仪，设置表9所示反应程序，进行末端修复/dA尾添加反应。
表9 末端修复/dA尾添加反应程序
| 温度 | 时间 |
| 热盖105°C | On |
| 30°C | 20 min |
| 72°C | 20 min |
| 4°C | Hold |
3.4 接头连接（Adapter Ligation）
该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端，连接特定的Illumina®接头。
1. 参考注意事项三中的表1，根据Input RNA量，稀释Adapter至合适浓度。
2. 将表10中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
3. 于3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表10所示反应体系。
表10 Adapter Ligation体系
| 名称 | 体积（μL） |
| dA-tailed DNA | 60 |
| Ligation Enhancer | 30* |
| Quick T4 DNA Ligase | 5 |
| DNA Adapter | 5** |
【注】：*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。
**请根据注意事项三中表1的提示，用0.1×TE buffer对接头进行稀释，接头体积固定为5 μL。
4. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
5. 将PCR管置于PCR仪中，设置表11所示反应程序，进行接头连接反应：
表11 Adapter Ligation反应程序
| 温度 | 时间 |
| 热盖105°C | Off |
| 20°C | 15 min |
| 4°C | Hold |
【注】：当Input DNA量较低时，可尝试将连接时间延长一倍，这将提高连接效率。
3.5 连接产物纯化和片段大小分选（Post Ligation Clean Up and Size Selection）
目前有两个方案应用于该步骤，当插入片段＜200 bp时，使用方案A；当插入片段≥200 bp时，使用方案B。
方案A：适用于插入片段150-200 bp的文库（mRNA打断方案为94°C，15 min）
1. 准备工作：将Hieff NGSTM DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取80 μL Hieff NGSTM DNA Selection Beads（0.8×，Beads:DNA=0.8:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
8. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行PCR扩增。
方案B：适用于插入片段大于200 bp的文库（mRNA打断方案为94°C，5~10 min）
方案B-1：接头连接产物的纯化
1. 准备工作：将Hieff NGSTM DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取80 μL Hieff NGSTM DNA Selection Beads（0.8×，Beads:DNA=0.8:1）至Adapter Ligation产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重复步骤5，总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。
8. 将PCR管从磁力架中取出，加入102 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，准备进行双轮分选。
【注】：ligation enhancer中含有的高浓度PEG 6000会对磁珠双轮分选产生影响，所以必须经过一轮纯化后再进行双轮分选。
方案B-2：双轮分选
1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。
2. 根据DNA片段长度要求，参考表12，在上述100 μL DNA中加入第一轮分选磁珠，涡旋或移液器吹打10次混匀。
表12 磁珠文库分选推荐比例
| DNA文库插入片段大小（峰值，bp） | ~ 200 | ~ 300 | ~ 400 | ~500 | |
| 94℃打断时间（min） | 10 ~ 15 min | ~ 10 min | ~ 8 min | ~ 6 min | |
| 短接头连接之后分选 | 第一轮体积比 | 0.82× | 0.72× | 0.62× | 0.58× |
| 第二轮体积比 | 0.2× | 0.15× | 0.15× | 0.1× | |
| 长接头连接之后分选或文库扩增之后分选 | 第一轮体积比 | 0.78× | 0.68× | 0.58× | 0.55× |
| 第二轮体积比 | 0.15× | 0.15× | 0.15× | 0.15× | |
【注】：此处文库大小指的是插入片段+短接头长度（60 bp）或插入片段+完整接头长度（120 bp），此表推荐的双轮分选比例适用于AMPure® XP磁珠和Hieff NGSTM DNA Selection Beads；表中“×”表示样品DNA体积。如短接头文库大小为360 bp，样品DNA体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.72×100 μL=72 μL；第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL；
3. 室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中，残留1-2 μL溶液于管底。
5. 参考表12向上清中加入第二轮分选磁珠。
6. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。
7. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。
8. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。
9. 重复步骤8。
10. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约5 min）。
11. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。
12. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移20 μL上清至干净管中。
3.6文库扩增（Library Amplification）
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。
1. 将表13中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。
2. 于无菌PCR管中配制表13所示反应体系。
表13-A 短接头连接产物PCR反应体系表 表13-B 长接头连接产物PCR反应体系
| 组分名称 | 体积（μL） |
| 2×Super CanaceTM II High-Fidelity Mix | 25 |
| Primer mix** | 5 |
| Adapter Ligated DNA | 20 |
| 组分名称 | 体积（μL） |
| 2×Super CanaceTM II High-Fidelity Mix | 25 |
| Universal Primer/ i5 Primer* | 2.5 |
| Index Primer/ i7 Primer* | 2.5 |
| Adapter Ligated DNA | 20 |
【注】：*如果使用的是无barcode的接头，俗称短接头（小Y接头），请使用短接头试剂中配备的index primer进行扩增（Cat#12611，Hieff NGSTM 96 Single Index Primer Kit for Illumina®, Set 1; Cat#12612, Hieff NGSTM 96 Single Index Primer Kit for Illumina®, Set 2。Cat#12613, Hieff NGSTM 384 Dual Index Primer Kit for Illumina® , Set 1; Cat#12614，Hieff NGSTM 384 Dual Index Primer Kit for Illumina® , Set 2。）
**如果您使用的是barcoded adapter，俗称长接头（大Y接头），即adapter上带有barcode，可使用本试剂盒中的Primer mix来进行扩增；
3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表14示反应程序，进行PCR扩增。
表14 PCR扩增反应程序
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 98°C | 1 min | 1 |
| 98°C | 10 sec | 参照表2（注意事项五） |
| 60°C | 30 sec | |
| 72°C | 30 sec | |
| 72°C | 5 min | 1 |
| 4°C | Hold | - |
3.7 扩增产物磁珠纯化或分选（Post Amplification Clean Up/Size Selection）
同3.5步骤中纯化操作步骤。使用Hieff NGSTM DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）纯化文库扩增产物。
3.8 文库质量控制
通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项六。
附录一：mRNA片段化
图2. mRNA不同打断时间对应的双链cDNA插入片段长度。取500 ng Universal Human Reference RNA，经过mRNA提取试剂盒提取后，分别以94°C处理5、10、15 min。打断后的mRNA进行双连cDNA的合成，经过1.8×磁珠回收后，所得结果通过Agilent 2100 Bioanalyer进行检测。
【注】：本结果使用的RNA是Universal Human Reference RNA，若使用其他来源的RNA，需要优化打断时间；若构建插入片段＞300 bp的文库，打断时间请选择5 min (此结果只展示片段化效果，并不代表产量的高低)。
附录二：应用实例
使用本试剂盒对500 ng Universal Human Reference RNA建库，mRNA打断时间为94°C，5 min，接头连接后进行双轮分选，产物经扩增、纯化后使用Agilent 2100 Bioanalyer进行检测。
图3. Universal Human Reference mRNA文库构建结果，从左往右依次使用0.8×/0.1、0.7×/0.1×、0.55×/0.1×双轮分选。
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