点击图片查看原图
产品内容：
试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5.0 mL 蒸馏水，混匀。
试剂三：液体×1 支，4℃保存。
产品说明：
GR 是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环的 关键酶之一(通常昆虫中 GR 被 TrxR 取代)。GR 催化 NADPH 还原 GSSG 生成 GSH，有助于维 持体内 GSH/GSSG 比值。GR 在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外 GR 还参与抗坏血 酸-谷胱甘肽循环途径。 GR能催化 NADPH 还原 GSSG 再生 GSH，同时不断消耗 NADPH 生成 NADP +；NADPH 在 340nm 有特征吸收峰，相反 NADP +在该波长无吸收峰；通过测定 340nm 吸光度下降速率；来测定 NADPH 脱氢速率，从而计算 GR 活性。
自备仪器和用品： 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、 1mL 石英比色皿和蒸馏水。
操作步骤：
一、粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（ml）1：5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10 4个）：试剂一体积（ml）为 500-1000：1 的比例（建议 500 万 细胞加入 1ml 试剂一），冰浴超声超声破碎细胞（功率 300w，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min）； 然后 10000rpm，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
二、GR 测定操作：
1. 分光光计预热 30 min 以上，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂一置于 25℃(普通物质)或者 37℃(哺乳动物)中预热 30min 以上。
3. 空白管：取 1mL 石英比色皿，加入 850μL 试剂一，100μL 试剂二，50μL 试剂三，充分混匀， 于 340nm 处测定 10 s 和 190 s 吸光度，记为 A 空 1 和 A 空 2，△A 空白管= A 空 1﹣A 空 2。
4. 测定管：取 1mL 石英比色皿，加入 750μL 试剂一，100μL 试剂二， 100μL 上清液，50μL 试 剂三，充分混匀，于 340nm 处测定 10 s 和 190 s 吸光度，记为 A 测 1 和 A 测 2，△A 测定 管= A 测 1﹣A 测 2。
注意：空白管只需要测定一次。
三、GR 活性计算：
(1) 按蛋白浓度计算
活性单位定义：在一定温度中， pH8.0 条件下，每 毫克蛋白每分钟催化 1μmol NADPH 氧化。
GR 酶活(U/mg prot)= [ (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×10 6] ÷(Cpr×V 样)÷T =0.536×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr
(2) 按样本质量计算
活性单位定义：在一定温度中， pH8.0 条件下，每克样本每分钟催化 1μmol NADPH 氧化。
GR 酶活(U/g)= [ (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×10 6] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T =0.536×(△A 测定管-△A 空白管)÷W
(3) 按细胞数量计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0 条件下，每 10 4个细胞每分钟催化 1μmol NADPH 氧化。
GR 酶活(U/10 4 cell)= [ (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×10 6] ÷(细胞数量×V 样÷V 样 总)÷T=0.536×(△A 测定管-△A 空白管)÷细胞数量
ε：NADPH 摩尔消光系数 6.22×10 3L/mol/cm；V 反总：反应体系总体，1000μL=0.001 L；10 6： 1 mol=1×10 6μmol；Cpr：上清液蛋白浓度（ mg/mL）；V 样：加入反应体系中上清液体积，100μL =0.1 mL；V 样总：加入提取液体积ˈ 1mL；W，样本质量，g；T：反应时间，3 min。
注意事项：
1. 样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；
2. 试剂二须现配现用，配置完后，置于冰上；
3. 测定前须先用 1～2 个样做预实验，确保 180s 内吸光值变化呈线性，哺乳动物组织一般须用试 剂一稀释 2～5 倍；
4. 细胞中 GR 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中 GR 的提取时可加试剂一 后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。
