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产品内容：
提取液：液体 110mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 2 mL 蒸馏水充分溶解。
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解。
试剂四：液体×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2mL 试剂一充分溶解。
产品说明：
MDHAR 催化 MDHA 还原生成 AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。 MDHAR 催化 NADH 还原 MDHA 生成 AsA 和 NAD+，NADH 在 340 nm 有特征吸收峰，但 是 NAD+没有。通过测定 340 nm 光吸收下降速率，来计算出 MDHAR 活性。
实验中所需仪器及设备： 研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可调式移液 枪和双蒸水
操作步骤:
一、粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）1：5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。10000rpm，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10 4个）：提取液体积（mL）为 500-1000：1 的比例（建议 500 万 细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声超声破碎细胞（功率 300w，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min）； 然后 10000rpm，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
二、MDHAR 测定操作：
1. 分光光度计预热 30 min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂一在 25℃水浴锅中预热 30 min。
3. 依次在石英比色皿中加入下列试剂
试剂名称(μL) | 试剂二 | 试剂三 | 试剂四 | 试剂一 | 蒸馏水 | 上清液 |
空白管 | 20 | 20 | 20 | 120 | 20 |
|
测定管 |
| 20 |
迅速混匀后于 340nm 比色，记录 30s 和 150s 的吸光值。分别记为 A1、A2，ΔA=A1-A2，得到 △A 测定、△A 空白。
三、MDHAR 活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol NADH 为 1U。
MDHAR (U/mg prot) = [(△A 测定-△A 空白)÷(ε×d)×V 反总×10 6]÷（Cpr×V 样）÷T =0.804×(△A 测定-△A 空白)÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每克样品每分钟氧化 1μmol NADH 为 1U。
MDHAR (U/g 鲜重) =[(△A 测定-△A 空白)÷(ε×d)×V 反总×10 6]÷(V 样÷V 样总×W)÷T =0.804×(△A 测定管-△A 空白管) ÷W
(3)按细胞数量计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每 10 4个细胞每分钟氧化 1μmol NADH 为 1U。
MDHAR (U/10 4 cell) =[ (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106]÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T =0.804×(△A 测定管-△A 空白管) ÷细胞数量 ε：NADH 摩尔消光系数，6220L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；10 6：1mol=1×10 6μmol；V 反 总：反应体系总体积，0.2mL=2×10 -4L；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V 样总： 提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司 蛋白质含量 BCA 试剂盒；W ：样品质量，g；T：反应时间，2min；细胞数量：万个。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：
（1）按蛋白浓度计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1μmol NADH 为 1U。
MDHAR (U/mg prot) = [(△A 测定-△A 空白)÷(ε×d)×V 反总×10 6]÷（Cpr×V 样）÷T =1.340×(△A 测定-△A 空白) ÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每克样品每分钟氧化 1μmol NADH 为 1U。
MDHAR (U/g 鲜重)=[(△A 测定-△A 空白)÷(ε×d)×V 反总×10 6]÷(V 样÷V 样总×W)÷T =1.340×(△A 测定-△A 空白) ÷W
(3)按细胞数量计算
MDHAR 活性单位定义：25℃中每 10 4个细胞每分钟氧化 1μmol NADH 为 1U。
MDHAR (U/10 4 cell) =[ (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106]÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T =1.340×(△A 测定管-△A 空白管) ÷细胞数量
ε：NADH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.6cm；10 6：1mol=1×10 6μmol；V 反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10 -4L；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V 样 总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本 公司蛋白质含量 BCA 试剂盒；W ：样品质量，g；T：反应时间，2min；细胞数量：万个。
