点击图片查看原图
产品内容：
试剂一：液体120mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体1mL×1支，4℃保存。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2.0mL蒸馏水，混匀。
产品说明：
GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，GR催化GSSG还原生成GSH，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH，有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR还参与抗坏血酸－谷胱甘肽循环途径。
GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH，同时NADPH脱氢生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，相反NADP+在该波长无吸收峰；通过测定340 nm吸光度下降速率来测定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。
自备仪器和用品：
低温离心机、水浴锅、移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板（UV板）和蒸馏水
操作步骤：
一、粗酶液提取：
称约0.1g组织，加入1.0 ml试剂一，冰上充分研磨，10000rpm 4℃离心10min，取上清液，待测。
二、GR测定操作：
1. 分光光度计或酶标仪预热30 min以上，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂一置于25℃（普通物质）或者37℃（哺乳动物）中预热30min以上。
3. 空白管：取微量石英比色皿或96孔板，加入10μL试剂二，20μL试剂三，170μL试剂一，于340nm测定10s和190s吸光度，记为A空1和A空2。
4. 测定管：取微量石英比色皿或96孔板，加入10μL试剂二，20μL试剂三，20μL上清液，150μL试剂一，于340nm测定10s和190s吸光度，记为A测1和A测2。
注：样品测定10s时吸光度后，将比色皿放入25℃（普通物质）或者37℃（哺乳动物）水浴，3min后拿出，吸打混匀，立即测定190s时的吸光度。
三、GR活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每毫克蛋白每分钟催化1μmol NADPH氧化为一个酶活力单位。
GR酶活(U/mg prot)= [ (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×106] ÷（Cpr×V样）÷T
= 0.536×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每克样品每分钟催化1μmol NADPH氧化为一个酶活力单位。
GR酶活(U/g 鲜重)= [ (△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×106] ÷(V样÷V样总×W)÷T
= 0.536×(△A测定管-△A空白管)÷W
△A空白管=A空1-A空2，△A测定管=A测1-A测2；ε：NADPH摩尔消光系数6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4 L；106：1 mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL =2×10-2 mL；V样总：提取液体积，1 mL；V样总：提取液体积， 1 mL；T：反应时间，3 min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每毫克蛋白每分钟催化1μmol NADPH氧化。
GR酶活(U/mg prot)= [ (△A测定-△A空白)÷(ε×d)×V反总×106]÷（Cpr×V样）÷T
=0.893×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每克样品每分钟催化1μmol NADPH氧化。
GR酶活(U/g鲜重)= [(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d)×V反总×106]÷(V样÷V样总×W÷T
=0.893×(△A测定管-△A空白管)÷W
△A空白管=A空1-A空2，△A测定管=A测1-A测2；ε：NADPH摩尔消光系数6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4 L；106：1 mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL =2×10-2 mL；V样总：提取液体积，1 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，3 min。
注意事项：
（1）样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；
（2）试剂三须现配现用，配置完后，置于冰上；
（3）测定前须先用1～2个样做预实验，确保180s内吸光值变化呈线性，哺乳动物组织一般须用试剂一稀释2～5倍；
（4）细胞中GR活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GR的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。
